[發明專利]以含酚類化合物為原料生產粘糠酸的基因工程菌

有效

• 申請號: 201910711002.4
• 申請日: 2019-08-02
• 公開（公告）號: CN112300974B
• 公開（公告）日: 2023-06-30
• 發明（設計）人: 金明杰;蔡成固;許召賢;徐美林
• 申請（專利權）人: 南京理工大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P7/44;C02F3/34;C02F101/34
• 代理公司: 南京理工大學專利中心 32203
• 代理人: 劉海霞

1.以含酚類化合物為原料生產粘糠酸的基因工程菌的構建方法，其特征在于，為將紅球菌中的粘糠酸環化異構酶基因和鄰苯二酚2,3雙加氧酶基因雙敲除得到的基因工程菌，通過以下方法構建：

步驟1，用于敲除基因的pk18mob-pheS骨架質粒的構建：合成引物PCR擴增紅球菌基因組中包含GenBank：AHK32253.1的苯丙氨酰-tRNA合成酶基因及其自身啟動子的核苷酸片段，其中上游引物為SEQ?ID?NO:1：tacccggggatcctctagaTGCGGTCCTCGACAGCATCAGCG，下游引物為SEQ?ID?NO:2：aacgacggccagtgccaagcttATTGCGCTACTCGCACGTCTGC，將含有自身啟動子序列的苯丙氨酰-tRNA合成酶基因和pk18mob質粒進行連接，獲得pk18mob-pheS骨架質粒；

步驟2，苯丙氨酰-tRNA轉運蛋白基因突變體的自殺質粒載體pK18mob-pheS*的構建：采用反向PCR技術將pk18mob-pheS骨架質粒中的苯丙氨酰-tRNA合成酶基因中編碼329位丙氨酸的核苷酸突變為編碼甘氨酸的核苷酸，其特異性引物：上游SEQ?ID?NO:3：GTACACCGGGTTCGGGTTCGGCATGGG，下游SEQ?ID?NO:4：CCCATGCCGAACCCGAACCCGGTGTAC，然后限制性內切酶Dpn?I酶切后轉化入大腸桿菌DH5α感受態細胞中，獲得自殺質粒載體pK18mob-pheS*；

步驟3，粘糠酸環化異構酶基因的敲除：采用重疊PCR方法，將紅球菌基因組中的粘糠酸環化異構酶基因兩端同源臂拼接后克隆到自殺質粒載體pK18mob-pheS*上，特異性引物：SEQ?ID?NO:5：acgaattcgagctcggtaccTACCCCAGCTTCTGCAGGGTG，SEQ?ID?NO:6：gtgccatcgggtggtgtgctccCGGATCACTTTCTCTACGGGTGG，SEQ?ID?NO:7：ccacccgtagagaaagtgatccgGGAGCACACCACCCGATGGCAC，SEQ?ID?NO:8：gcctgcaggtcgactctagaCACCCAGCTGGCCATCTGCG，獲得自殺型質粒?pK18mob-pheS*-MC，再轉入到紅球菌Rhodococcus?opacus?PD630中，獲得敲除粘糠酸環化異構酶基因的菌株R.-MA1；

步驟4，鄰苯二酚2,3雙加氧酶基因的敲除：采用重疊PCR方法，將紅球菌基因組中的鄰苯二酚2,3雙加氧酶基因兩端同源臂拼接后克隆到自殺質粒載體pK18mob-pheS*上，特異性引物如下：SEQ?ID?NO:9：acgaattcgagctcggtaccGGCCAACGGCGTGAAGCCGGC，SEQ?ID?NO:10：caggcccccacaccgaggacaactcGACACGGGACGCACCGTCGAAAGGGAC，SEQ?ID?NO:11：gtccctttcgacggtgcgtcccgtgtcGAGTTGTCCTCGGTGTGGGGGCCTG，SEQ?ID?NO:12：tgtcgaggaccgcatctagaGAGCGGGACGACCTCCTGCTGCG，獲得自殺型質粒pK18mob-pheS*-C23D，再轉入到R.-MA1中，獲得敲除粘糠酸環化異構酶基因和鄰苯二酚2,3雙加氧酶基因的菌株R.?opacus?PD630-MA2。

2.根據權利要求1所述的構建方法在含酚類化合物廢水處理中的應用。

3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，應用方法為將基因工程菌接種到含酚類化合物廢水中，曝氣處理，將含酚類化合物轉化為粘糠酸。

4.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，以單一菌株或混合菌株將基因工程菌接種到含酚類化合物廢水中。

5.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，以游離形式或固定化形式將基因工程菌接種于含酚類物質的廢水中。