[發(fā)明專利]一種超低溫冷凍及封閉式保存方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910709712.3
• 申請日: 2019-08-02
• 公開（公告）號: CN110521720B
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 彭秋平;薛松果;王榮祥;彭文林;胥堯;匡延平
• 申請（專利權(quán)）人: 上海廩典實業(yè)有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 北京市環(huán)球律師事務(wù)所 11663
• 代理人: 向憶華

本發(fā)明提供一種超低溫冷凍及封閉式保存方法，其包括如下步驟：1)提供一具有開口的無菌容器；2)將所述無菌容器置于初始冷源中，且所述無菌容器開口的高度高于所述初始冷源的液面層；3)在所述無菌容器中形成液化氣體，作為無菌制冷劑；4)將承載在載體上的待冷凍樣品置于所述無菌制冷劑中進(jìn)行玻璃化冷凍；5)密封所述無菌容器，并將所述密封無菌容器與密封在其中的玻璃化冷凍樣品一起超低溫保存。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物樣品保存領(lǐng)域，尤其涉及一種超低溫冷凍及封閉式保存方法。

背景技術(shù)

醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)(包括輔助生殖)、食品、化工等領(lǐng)域均需要用到超低溫保存。超低溫保存需要使用冷源，冷源包括但不限于液氮等常規(guī)制冷劑。

以人輔助生殖領(lǐng)域為例，該領(lǐng)域需要進(jìn)行胚胎、卵子等細(xì)胞樣本的冷凍保存，液氮是主要的冷源。玻璃化冷凍因為降溫速率快(20,000℃/min以上)、復(fù)蘇存活率高(≥95％)成為目前人胚胎和卵子冷凍的主要方法。然而，玻璃化冷凍技術(shù)潛在的污染風(fēng)險一直困擾著輔助生殖從業(yè)人員。在玻璃化冷凍過程中，需要將裝載在冷凍載桿上的胚胎樣本與液氮等冷源直接接觸。這是因為，只有直接接觸液氮才能達(dá)到超快速降溫，從而保證復(fù)蘇存活率。而市售液氮等冷源在生產(chǎn)、運輸以及液氮罐等其他儲存罐內(nèi)長期保存等環(huán)節(jié)均有可能被細(xì)菌、病毒、真菌等病原微生物污染。致病微生物可以耐受低溫并在復(fù)蘇后具有污染和交叉感染風(fēng)險，所以開放式玻璃化凍存的胚胎具有潛在的污染風(fēng)險。為了避免污染或交叉污染，封閉式拉細(xì)麥管(CPS，closed pulled straws)、麥管套麥管(straw-in-straw)和Rapid-i等封閉式玻璃化冷凍方法被應(yīng)用于輔助生殖臨床，但存活率欠佳，未能廣泛使用。CPS、麥管套麥管和Rapid-i等封閉式玻璃化冷凍方法均是將裝載胚胎的冷凍載體插入外套管封閉后再投入液氮實現(xiàn)樣本凍結(jié)，降溫速率慢(僅約2,000℃/min左右)，導(dǎo)致解凍存活率低。

中國專利(申請?zhí)?01720870512.2)提供一種在液氮工廠生產(chǎn)無菌液氮的設(shè)備和方法。雖然生產(chǎn)的液氮無菌，但液氮在運輸、儲存和使用過程中維持無菌的狀態(tài)極其困難。而且，細(xì)菌或病毒感染患者的胚胎還可能在液氮罐內(nèi)間接將病原傳遞給其他“健康”胚胎，導(dǎo)致胚胎發(fā)生交叉感染。

因此，亟需一種既能快速降溫，又能避免冷源對樣品污染的保存方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種超低溫冷凍及封閉式保存方法，其能夠按照開放式載體的操作方法實現(xiàn)生物樣本的無菌保存，徹底避免開放式載體玻璃化冷凍的污染或交叉污染風(fēng)險，并且不影響降溫速率、不會降低胚胎存活率。

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種超低溫冷凍及封閉式保存方法，其包括如下步驟：

1)提供一具有開口的無菌容器；

2)將所述無菌容器置于初始冷源中，且所述無菌容器開口的高度高于所述初始冷源的液面層；

3)在所述無菌容器中形成液化氣體，作為無菌制冷劑；

4)將承載在載體上的待冷凍樣品置于所述無菌制冷劑中進(jìn)行玻璃化冷凍；

5)密封所述無菌容器，并將所述密封無菌容器與密封在其中的玻璃化冷凍樣品一起超低溫保存。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述無菌容器的開口高于所述初始冷源所形成的蒸汽層。

在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述初始冷源是液氮、液氦或者其他超低溫冷源。