[發明專利]抗人AQPs自身抗體檢測試劑盒及制備方法

在審

• 申請號: 201910700521.0
• 申請日: 2019-07-31
• 公開（公告）號: CN112305225A
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 張星虎;尹琳琳;萇浩曉;要雅君;王化冰;叢衡日;魏玉幀;周衡;馬越濤;杜利
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學附屬北京天壇醫院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/533;G01N21/64
• 代理公司: 北京天昊聯合知識產權代理有限公司 11112
• 代理人: 樊曉煥;張蘇娜

1.一種檢測人AQPs自身抗體的間接免疫熒光試劑盒所需微血管和血管內皮豐富的AQPs高表達腦區切片檢測組件制備方法，其特征在于所選特定腦區的微血管和血管內皮表達豐富，AQPs高表達，包括以下步驟：

1)微血管和血管內皮豐富的AQPs高表達腦區切片制備：鼠腦冠狀面冰凍切片，保留有微血管和血管內皮豐富的AQPs高表達腦區切片，切片區域為囟門前1.18mm至囟門后0.1mm，；

2)制成檢測組件：切好的鼠腦片貼在可拆卸載玻片的方格內，4℃低溫保存待用。

2.根據權利要求1所述檢測人AQPs自身抗體的間接免疫熒光試劑盒用的微血管和血管內皮豐富的AQPs高表達腦區切片檢測組件制備方法，其特征在于，所述步驟1)微血管和血管內皮豐富的AQPs高表達腦區切片制備包括以下步驟：

1.1)小鼠麻醉后心臟灌流，生理鹽水排空血液，多聚甲醛固定液灌注，固定后取腦；

1.2)OCT包埋后冰凍切片，沿中線切為左右半腦，冠狀面切片選擇從囟門前1.18mm至囟門后0.1mm處的腦片，厚度為10-50μm。

3.一種檢測人AQPs自身抗體的間接免疫熒光試劑盒,其特征在于：所述試劑盒包括根據以上任一權利要求所制備的微血管和血管內皮豐富的AQPs高表達腦區切片檢測組件、封閉液、PBST、封片劑、陰性對照、抗人熒光二抗。

4.根據權利要求3所述檢測人AQPs自身抗體的間接免疫熒光試劑盒，其特征在于：所述微血管和血管內皮豐富的AQPs高表達腦區切片檢測組件由微血管和血管內皮豐富的AQPs高表達腦區切片和含有小室的載玻片制備而成，其中，含有小室的載玻片為含有多個小室的可拆卸載玻片；所述封閉液為5％BSA；所述陰性對照為正常人血清；所述PBST按照3‰曲拉通X-100和PBS配成。

5.一種用于檢測人AQPs自身抗體的試劑盒的應用方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)將根據權利要求1所制備的微血管和血管內皮豐富的AQPs高表達腦區切片檢測組件放置室溫平衡20min，每個方格內加100μl含有5％BSA的PSBT封閉液37℃封閉20min；

2)棄去封閉液；加入稀釋后的待檢的血清或腦脊液樣本100μl，并設置一個方格作為陰性對照，加等量稀釋后正常人血清，37℃孵育1H；待檢血清樣本用PBST 1:10稀釋；待檢腦脊液樣本不稀釋；陰性對照用PBST 1:10稀釋；

3)棄去液體，PBST清洗3次，每次5min；

4)PBST 1:500稀釋Alexa Fluor488標記的抗人熒光二抗，37℃避光孵育30min；

5)重復3)PBST 3×5min清洗，棄去液體后滴加少許封片劑封片，熒光顯微鏡下觀測，拍照記錄結果。