[發(fā)明專利]一種鯉皰疹病毒Ⅱ型ORF66蛋白重組桿狀病毒表達載體及其制備方法

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• 申請日: 2019-07-31
• 公開（公告）號: CN110408655A
• 公開（公告）日: 2019-11-05
• 發(fā)明（設計）人: 李強;欒林林
• 申請（專利權）人: 鹽城工學院
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N15/66;C12N15/38
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 吳爽

本發(fā)明提供了一種鯉皰疹病毒Ⅱ型ORF66蛋白重組桿狀病毒表達載體及其制備方法，其是以提取的CyHV?2 cDNA為模板，擴增出ORF66基因，將擴增的ORF66基因連接至桿狀病毒載體pFastBacHTA中，構建重組桿狀病毒載體pFastBac HTA?CyHV?ORF66，轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞DH10Bac中，獲得重組穿梭桿粒rBacmid?CyHV?ORF66，鑒定正確后將其轉染至Sf9昆蟲細胞，獲得重組桿狀病毒，并將重組桿狀病毒進行傳代擴增，將高滴度的含有CyHV?2?ORF66基因的桿狀病毒接種到sf9昆蟲細胞中進行CyHV?2?ORF66蛋白的真核表達。選用本發(fā)明方法構建鯉皰疹病毒Ⅱ型ORF66蛋白重組桿狀病毒表達載體，并利用重組桿狀病毒表達系統(tǒng)在昆蟲細胞中表達鯉皰疹病毒Ⅱ型ORF66蛋白，為制備鯉皰疹病毒Ⅱ型ORF66蛋白特異性單抗提供了材料，為鯉皰疹病毒血清學ELISA檢測方法的建立奠定了基礎。

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術中基因重組表達領域，特別涉及一種鯉皰疹病毒Ⅱ型ORF66蛋白重組桿狀病毒表達載體及其制備方法。

背景技術

鯉皰疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)是造成鯽造血器官壞死病的病原，該病毒隸屬于皰疹病毒目(Herpesvirales)、魚皰疹病毒科(Alloherpesviridae)、鯉皰疹病毒屬(Cyprinivirus)，CyHV-2與分離自鯉科魚類的另外兩種病毒鯉皰疹毒1(Cyprinid herpesvirus 1,CyHV-1)和鯉皰疹病毒3(Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)親緣關系較近,與溝鲇皰疹病毒(Ictalurid herpes-virus 1,IcHV-1)關系相對較遠。在病原學方面，CyHV-2具有魚類皰疹病毒的一般特征。病毒呈球形，具有二十面體立體對稱的衣殼結構，內(nèi)部包有長度約為290,304bp的雙股DNA，外面為皮質層和囊膜。現(xiàn)已確認，魚類皰疹病毒基因組含有12個核心ORF，這些編碼蛋白在CyHV-1和CyHV-3中均有分布，主要參與病毒復制、裝配以及衣殼的形成等過程。Jung等在1995年對CyHV-2進行了第一次報道,發(fā)現(xiàn)CyHV-2是金魚造血器官壞死病的致病病原。之后在美國、澳大利亞、中國臺灣、英國養(yǎng)殖的金魚也暴發(fā)該病。自從2011年匈牙利首次在養(yǎng)殖的鯽魚體內(nèi)檢測到CyHV-2后，近幾年來關于CyHV-2感染鯽魚的報道也逐漸增多,該病毒在中國、日本、美國、澳大利亞、英國、新西蘭等地廣泛傳播，造成養(yǎng)殖鯽魚和金魚大量死亡。這些報道均表明CyHV-2是一種新生養(yǎng)殖鯽魚病毒病，其發(fā)病區(qū)域在逐年擴大。CyHV-2病害已經(jīng)引起我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)管理部門及養(yǎng)殖戶高度重視。目前還沒有能防治的疫苗，必須建立一種快速而又能準確檢測診斷本病的方法。

近幾年，國內(nèi)外學者陸續(xù)也報道一些CyHV-2的檢測方法。Goodwin(2006)等針對CyHV-2聚合酶基因建立了PCR技術，從患病金魚的病變組織的均擴增出病毒的核酸片段；隨后，他們又建立了基于聚合酶基因的實時定量PCR法，最低檢測限為1個病毒基因拷貝；Waltzek等(2005)根據(jù)病毒解旋酶基因，建立了PCR檢測方法，該方法對CyHV-1，CyHV-3的樣品均無擴增。He等(2013)根據(jù)末端酶基因序列，建立了檢測CyHV-2的LAMP檢測方法，該方法具有較高的靈敏度，可在10min內(nèi)完成檢測。雖然分子生物學檢測技術具有較高的靈敏性，但也易因模板污染而引起假陽性現(xiàn)象，因此，不能將其作為診斷CyHV-2感染的唯一標準。另一方面，由于分子生物學等技術需要昂貴的儀器設備、較高檢測費用以及對檢測人員較高的技術要求而使其不適用于現(xiàn)場快速檢測及基層普及應用。鑒于免疫學檢測方法快速、簡便的特點，亟需開發(fā)一種快速簡便的檢測技術，以滿足該病的現(xiàn)場快速診斷的需要。膠體金診斷試紙條是一種采用雙抗夾心ELISA模式開發(fā)的新型免疫學檢測工具，具有簡便快速、肉眼判斷、放大反應等優(yōu)點，一般只要5-10分鐘就可快速檢測，能極大滿足基層現(xiàn)場檢測病毒的要求。膠體金診斷試紙條的核心部件是針對病原的特異性單克隆抗體，要想獲得特異性單抗必須有高純度高活性的特異性抗原。