[發(fā)明專利]展示豬瘟病毒E2蛋白主要抗原區(qū)的霍亂弧菌菌影構(gòu)建及制備

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910696035.6
• 申請(qǐng)日: 2019-07-30
• 公開（公告）號(hào): CN110408582B
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊夢(mèng)華;姬生樂;韓美晴;杜麗宏;彭名正;徐思艷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/74;C12N15/66;C12N15/34;A61K39/187;A61P31/14
• 代理公司: 南京眾聯(lián)專利代理有限公司 32206
• 代理人: 朱欣欣

1.一種展示豬瘟病毒E2蛋白主要抗原區(qū)的霍亂弧菌菌影，其特征在于，制備方法包括如下步驟：

（1）構(gòu)建tcpP-E2蛋白融合蛋白表達(dá)載體pJSL13；

（2）制備霍亂弧菌ΔtcpP缺失株感受態(tài)細(xì)胞；

（3）將pJSL13及溫控誘導(dǎo)裂解質(zhì)粒pBV220-E共同轉(zhuǎn)入霍亂弧菌ΔtcpP缺失株感受態(tài)細(xì)胞，得到E2-rVC；

（4）誘導(dǎo)E2-rVC表達(dá)融合蛋白tcpP-E2并制備菌影E2-rVCG；

所述步驟（1）具體為：

1）以霍亂弧菌基因組為模板擴(kuò)增tcpP基因上游片段，以人工合成的E2蛋白ABCD四區(qū)基因?yàn)槟０鍞U(kuò)增下游片段，上下游片段進(jìn)行純化，將純化好的上下游片段通過OverlappingPCR拼接為一條片段tcpP-E2；

2）將融合表達(dá)基因tcpP-E2片段與載體pacyc-aphB用EcoRI，PstI內(nèi)切酶進(jìn)行酶切；

3）酶切過后的基因片段與載體片段進(jìn)行酶連，酶連產(chǎn)物純化后電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5αλpir中，得到pJSL8；

4）以pBAD24-tcpH質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增Pbad-tcpH基因片段，將Pbad-tcpH片段與pJSL8質(zhì)粒分別進(jìn)行PstI單酶切，將酶切片段與酶切載體酶連，酶連產(chǎn)物純化后電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5αλpir中，得到pJSL13。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種展示豬瘟病毒E2蛋白主要抗原區(qū)的霍亂弧菌菌影，其特征在于：所述步驟（3）中反應(yīng)溫度為30℃。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種展示豬瘟病毒E2蛋白主要抗原區(qū)的霍亂弧菌菌影，其特征在于：所述步驟（4）中誘導(dǎo)的反應(yīng)條件：OD₆₀₀ =0.3時(shí)，30℃，200 rpm下加入0.1% Ara誘導(dǎo)tcpP-E2重組蛋白表達(dá)；OD₆₀₀=0.7時(shí)，42℃，60 rpm下誘導(dǎo)裂解E蛋白表達(dá)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種展示豬瘟病毒E2蛋白主要抗原區(qū)的霍亂弧菌菌影，其特征在于：所述霍亂弧菌為O1血清型霍亂弧菌C6706。