[發明專利]一種雙光子比率型熒光探針在檢測單胺氧化酶B中的應用

有效

• 申請號: 201910695240.0
• 申請日: 2019-07-30
• 公開（公告）號: CN110218215B
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發明（設計）人: 顏梅;衛先哲;張晶;王建榮;張樂淘;武虹樂
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: C07D493/10
• 分類號: C07D493/10;G01N21/64
• 代理公司: 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業) 37240
• 代理人: 趙鳳

本發明公開了一種雙光子比率型熒光探針精確測量腫瘤細胞中的單胺氧化酶B的制備方法和應用。該探針基于熒光共振能量轉移機理，利用酶促氧化脫氨基反應產生相應的亞胺離子，經水解后消除，重新釋放羥基，導致熒光發射信號比例性的變化。優勢在于，能量供體與受體之間的熒光光譜距離更大，光譜之間的干擾更小，靈敏度更高，有效避免了各種環境條件對分析的干擾。為臨床用于檢測活體內阿爾茲海默癥的重要標志酶提供了潛在工具。

技術領域

本發明涉及小分子熒光探針鑒定異常的生物酶活性在癌細胞中的位置和表達水平，更具體地說是一種基于熒光共振能量轉移的雙光子萘衍生物熒光探針對阿爾茲海默癥的重要標志物單胺氧化酶B（MAO-B）的檢測。

背景技術

阿爾茲海默癥（AD）是老年人中最常見的癡呆癥，目前影響全球超過3500萬人。特別地，與其相關生物標志物的臨床檢測對于疾病的早期診斷，治療和管理具有重要意義。單胺氧化酶B（MAO-B）是線粒體結合的黃素酶,在人腦中高度表達,主要存在于星形膠質細胞，其有助于維持大腦中神經遞質的穩態，從而確保適當的神經和行為結果。目前，已經證明MAO-B的過度活化會導致產生過量的神經毒性副產物，如H₂O₂，從而引發以AD為典型代表的精神疾病和神經退行性疾病。因此，鑒定生物標志酶在神經細胞中的位置和表達水平成為早期病癥的診斷和監測治療的關鍵，也是當前該研究領域亟需解決的問題之一。

目前已經應用了幾種成像技術來檢測或成像酶，例如磁共振成像（MRI），核成像（包括單光子發射計算機斷層掃描（SPECT）和正電子發射斷層掃描（PET））以及熒光成像。每一種技術都是不可替代的，具有自己的特征靈敏度，穿透深度和空間分辨率。例如，MRI對活癌細胞中低豐度的酶缺乏足夠的特異性和敏感性。SPECT和PET具有高靈敏度和斷層掃描能力，但空間分辨率較差（1-2 mm）。其他一些檢測方法，如使用標記抗體或蛋白質組學方法，可用于檢測和跟蹤固定細胞中的酶或在體外進行檢測，但未能提供活細胞中酶的實時信息。為了克服這些缺點，基于小分子熒光探針的熒光成像技術已被廣泛用于可視化和量化活細胞動態過程中，其具有靈敏度高，非破壞性快速分析和實時檢測的優勢。

大多數小分子酶熒光探針是基于探針與酶活性位點的特異性相互作用而設計的，包括催化位點和結合位點。酶具有區分各種底物之間微小差異和催化底物特異性反應的能力，通過將最佳底物基團連接到熒光團來產生基于底物的探針，熒光團在活性酶催化時其光譜性質相應改變。在基于FRET的探針中，熒光團和底物通過酶可水解的識別底物在一定距離內彼此連接，以產生比率型探針，其在底物通過特異性酶催化反應釋放后恢復熒光。總之，理想的小分子酶探針在靶酶催化的化學修飾后應產生可檢測的熒光變化，本文中，設計并合成了一種新的雙光子高效比率型熒光化合物（FTP-B），用于檢測生物系統中單胺氧化酶B（MAO-B）的活性。

發明內容

本發明要解決的技術問題：一是提供一種原料廉價易得，合成步驟簡單，反應條件溫和的熒光探針合成方法。二是提供了一種具有大斯托克斯位移、檢測速度快、選擇性強、靈敏度高、低細胞毒性，用于檢測生物樣品、活細胞和動物中的MAO-B的新型比率雙光子熒光探針。

為了解決上述技術問題，采取的技術方案如下，一種特異性識別MAO-B的比率雙光子熒光探針，具有如下分子結構式：

上述單胺氧化酶B熒光探針的制備方法如下：

1）將1 eq的Np-Rhod染料與2.5 eq碳酸鉀，溶解于無水N，N-二甲基甲酰胺中，然后向混合液中加入3 eq的1，3-二溴丙烷，室溫下攪拌4 h后升溫至60℃回流12 h。用TCL板監測反應，反應完全后，用二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸發，并用硅膠柱進行分離，得到化合物FTP-B1，其結構式如下：