[發明專利]數字PCR檢測長牡蠣多巴胺-β-羥化酶表達水平的引物及探針

在審

• 申請號: 201910693602.2
• 申請日: 2019-07-30
• 公開（公告）號: CN110373478A
• 公開（公告）日: 2019-10-25
• 發明（設計）人: 王玲玲;劉兆群;張玉坤;宋林生;孔寧
• 申請（專利權）人: 大連海洋大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 大連非凡專利事務所 21220
• 代理人: 閃紅霞

本發明公開一種數字PCR檢測長牡蠣多巴胺?β?羥化酶表達水平的引物及探針，所述引物及探針核苷酸序列如下：正向引物：5’?tggcggaccactctctacatc?3’；反向引物：5’?tctccgcgacatcatctgaat?3’；探針：5’?cttcttccagctagcgaacgcaacaca?3’；所述探針添加的熒光基團為6?羧基熒光素。引物及探針的準確性和特異性高，故可利用數字PCR技術檢測長牡蠣血淋巴細胞中NE合成酶CgDBH絕對量的時序變化，以此作為評價養殖長牡蠣健康狀況的指標，所建立的評價體系在養殖貝類病害預警預報中具有潛在應用價值。不需要設置對照組，也無需內參基因（Internal control），突破了傳統熒光實時定量PCR檢測方法的應用局限。

技術領域

本發明屬于分子生物學和生物化學技術領域，涉及一種數字PCR檢測長牡蠣多巴胺-β-羥化酶表達水平的引物及探針。

背景技術

去甲腎上腺素(Norepinephrine, NE)屬于兒茶酚胺類(Catecholamines, CAs)神經遞質，是神經內分泌免疫系統中的重要調節分子。NE通過結合免疫細胞胞膜上的腎上腺素能受體（Adrenoceptor，ADR）來調節其免疫應答能力，同時，NE在不同的免疫內環境中結合不同類型的ADRs，產生不同的免疫調節效應。例如，在某些免疫細胞中α2 型腎上腺素能受體能通過 PKC 的活化、IκB 的磷酸化和 NF-κB 的激活，促進 TNF-α、IL-1、IL-6 和 IL-10 的產生和釋放；β 型腎上腺素能受體（主要是 β2）通過 cAMP-PKA 通路，來抑制 NF-κB對免疫相關基因的轉錄。當α2 型腎上腺素能受體和β型腎上腺素能受體都被激活時，β型腎上腺素能受體的作用占優勢。

近期的研究發現，貝類是具有完善神經內分泌免疫調節系統的最低等動物，NE在貝類免疫應答中發揮了至關重要的作用。鰻弧菌刺激后，櫛孔扇貝血淋巴中NE的濃度顯著上升，同時血淋巴細胞中NE合成酶（多巴胺-β-羥化酶，CgDBH）、CfMAO和 CfADR的 mRNA表達水平也顯著升高。CfMAO被干擾后，血淋巴細胞中超氧化物歧化酶(CfSOD)的 mRNA 表達水平顯著低于對照組。此外，研究發現LPS刺激能夠誘導長牡蠣血淋巴細胞合成NE，進而調節血細胞的吞噬活性和凋亡指數。

熒光實時定量PCR（Quantitative real-time PCR，簡稱qPCR）是用于檢測基因mRNA表達水平的經典方法。但此方法只能用于檢測基因的相對表達水平，需要設置對照組并選取合適的管家基因作為內參，因此qPCR技術的應用具有很大局限性。相對地，數字PCR是一種核酸分子絕對定量技術，能夠直接檢出DNA分子的個數，是對起始樣品的絕對定量，符合野外調查的需要。但是，迄今為止，沒有關于數字PCR檢測長牡蠣多巴胺-β-羥化酶表達水平的引物及探針的相關報道，以至于并沒有基于數字PCR檢測長牡蠣多巴胺-β-羥化酶表達水平的時序變化并以此作為評價養殖長牡蠣健康狀況的指標。

發明內容

本發明是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種數字PCR檢測長牡蠣多巴胺-β-羥化酶表達水平的引物及探針。

本發明的技術解決方案是：一種數字PCR檢測長牡蠣多巴胺-β-羥化酶表達水平的引物及探針，其特征在于所述引物及探針核苷酸序列如下：

正向引物：5’- TGGCGGACCACTCTCTACATC-3’；

反向引物：5’- TCTCCGCGACATCATCTGAAT-3’；

探針：5’- CTTCTTCCAGCTAGCGAACGCAACACA-3’；

所述探針添加的熒光基團為6-羧基熒光素。