[發(fā)明專利]基于活細胞3D打印的組織工程仿生肝葉結(jié)構(gòu)及制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910692415.2
• 申請日: 2019-07-30
• 公開（公告）號: CN110403731B
• 公開（公告）日: 2021-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周強;葉吉星;甘翼搏;李培;王利元;歐陽斌;涂兵
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院
• 主分類號: A61F2/02
• 分類號: A61F2/02;A61L27/38;B29C64/112;B33Y10/00;B33Y70/00;B33Y80/00
• 代理公司: 重慶志合專利事務(wù)所(普通合伙) 50210
• 代理人: 胡榮琿

本發(fā)明公開了一種基于活細胞3D打印的組織工程仿生肝葉結(jié)構(gòu)及制備方法，其首先采集人體肝葉的生物信息，并輸入計算機進行高仿生建模；然后通過生物3D打印機，利用水凝膠材料和用于構(gòu)建人肝葉所需的肝、膽管上皮、血管內(nèi)皮、平滑肌和成纖維等細胞進行材料單獨打印與材料?細胞混合打印輸出，其中血管和膽管中的空洞部分用鑄型劑打印；在所有水凝膠材料固化后，通過酶或螯合反應(yīng)或溫控或光照等手段去除血管和膽管中的鑄型劑，構(gòu)造出人工含膽管肝葉中的血管系統(tǒng)和膽管系統(tǒng)，通過血管系統(tǒng)兩端的主血管與培養(yǎng)液輸送管連接，實現(xiàn)仿生肝葉的血管系統(tǒng)循環(huán)供養(yǎng)與氣體交換。其實現(xiàn)了仿生肝葉在體內(nèi)外的長期存活和生物功能。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學工程，特別涉及一種基于活細胞3D打印的組織工程仿生肝葉結(jié)構(gòu)及制備方法，即采用生物3D打印的方式，制備出能長期存活和具有生物功能的人工血管化含膽管肝葉。

背景技術(shù)

現(xiàn)有的人工組織通常采用細胞的體外三維培養(yǎng)來制備，只能制備出小體積人工組織。當人工組織的厚度超過2毫米時就會造成組織深部供養(yǎng)障礙，導(dǎo)致人工組織難以長期存活。為解決深部供養(yǎng)障礙的問題，國內(nèi)外研究者進行了多種不同的探索。例如將細胞接種在多孔支架上并浸泡在培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，使得營養(yǎng)物質(zhì)能夠通過孔道到達細胞處，但是該方法存在一定的局限性：隨著細胞的生長，支架中的孔道會被細胞填滿而阻塞營養(yǎng)物質(zhì)的流通，并且該方法所形成的大體積人工組織由于有支架材料的阻隔難以形成如正常組織中的細胞功能集成；另外也有研究者采用能誘導(dǎo)血管長入的水凝膠材料來包裹細胞培養(yǎng)形成大體積人工組織并植入體內(nèi)，讓逐步長入的血管來供養(yǎng)，但是該方法任然存在深部供養(yǎng)障礙的問題，在血管還沒有長入深部的時候，深部的細胞就已經(jīng)因為缺少養(yǎng)分而死亡，難以實現(xiàn)真正的大體積人工組織的長期存活。

隨著能夠打印活細胞的生物3D打印技術(shù)的發(fā)展，人們開始利用生物3D打印技術(shù)來制備各種人工組織，其中就包括人工血管與人工肝組織。生物3D打印人工血管的出現(xiàn)，使得大體積人工組織的深部供養(yǎng)成為可能。現(xiàn)有最先進的生物3D打印人工肝組織主要是：1、杭州捷諾飛公司應(yīng)用生物3D打印技術(shù)，以肝組織解剖學和生理學數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，模擬肝小葉構(gòu)建三維模型，用人肝干細胞打印具有功能結(jié)構(gòu)的肝單元產(chǎn)品Regenovo3D Liver。打印的肝單元體積為人體肝小葉（高2mm，寬1mm）的10倍，并且可以在實驗室條件下存活超過3個月，具有一定的肝葉功能；2、美國 Organovo 公司生產(chǎn)的微型肝葉產(chǎn)品exVive3D，其只有 0.5mm 厚、4 mm 見方。為制造這種結(jié)構(gòu)，打印機疊加了約 20 層肝組織細胞和肝星狀細胞，這是兩種主要的肝細胞，另外還同時打印了血管內(nèi)皮細胞，這些細胞形成管道網(wǎng)向肝細胞供應(yīng)養(yǎng)分和氧氣，使組織得以存活五天以上并具有一定的肝葉功能。

其中第一個產(chǎn)品存在使用細胞單一導(dǎo)致的功能不全問題和無血管系統(tǒng)導(dǎo)致的供養(yǎng)距離不足問題。由于血管網(wǎng)構(gòu)建不完善，導(dǎo)致供養(yǎng)距離太短，所以打印的肝組織都較小（最厚處不超過5mm）。第二個產(chǎn)品存在存活時間較短、力學強度差和血管結(jié)構(gòu)簡單（構(gòu)成細胞單一、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)簡單）的問題。這兩個產(chǎn)品受到血管系統(tǒng)系統(tǒng)和體外供養(yǎng)系統(tǒng)不全的限制，都存在打印的人工肝組織尺寸受限的問題，尺寸受限后就沒有辦法仿生大體積肝組織所具有的一些功能，比如缺少膽管這一結(jié)構(gòu)，缺少膽汁運輸功能。有些公司的產(chǎn)品通過打印時摻入內(nèi)皮細胞，可能會形成一些管道，但是并不會形成具有血管完全功能（滲透、運輸、聯(lián)通循環(huán)）的血管網(wǎng)，這些形成的管道與真正的血管網(wǎng)的功能大相徑庭。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于活細胞3D打印的組織工程仿生肝葉結(jié)構(gòu)及制備方法，采用生物3D打印技術(shù)來制備人工含膽管肝葉，使之模擬人體肝葉的結(jié)構(gòu)與生物功能，以實現(xiàn)人工含膽管肝葉在體內(nèi)外的長期存活和生物功能。

本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：

一種基于活細胞3D打印的組織工程仿生肝葉的制備方法，包括如下步驟：

1）建模：