[發明專利]一種人子宮內膜干細胞復合修復因子的制備方法及應用

在審

• 申請號: 201910692005.8
• 申請日: 2019-07-30
• 公開（公告）號: CN110384716A
• 公開（公告）日: 2019-10-29
• 發明（設計）人: 楊永利
• 申請（專利權）人: 楊永利
• 主分類號: A61K35/545
• 分類號: A61K35/545;A61K9/08;A61P15/00;A61P15/08;A61P29/00;A61P35/00;C12N5/074
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1.一種人子宮內膜干細胞復合修復因子的制備方法，其特征在于：具體包括如下步驟：

S1、從人子宮內膜組織中分離得到人子宮內膜干細胞；

S2、人子宮內膜干細胞經體外消化分離與擴大培養，獲得高質量的人子宮內膜干細胞；

S3、再將高質量的人子宮內膜干細胞進行工廠化放大培養，收集P3-P6代的干細胞培養上清液；

S4、干細胞培養上清液經濃縮、蛋白含量測定、質檢，得到人子宮內膜干細胞濃縮因子；

S5、將人子宮內膜干細胞濃縮因子與凍干保護劑混合后，冷凍干燥得到人子宮內膜干細胞凍干粉；

S6、將人子宮內膜干細胞凍干粉與溶媒混合，即獲得人子宮內膜干細胞復合修復因子。

2.根據權利要求1所述的一種人子宮內膜干細胞復合修復因子的制備方法，其特征在于：所述步驟S2中人子宮內膜干細胞體外消化分離與擴大培養方法的具體步驟為：

步驟一：在超凈臺內，對獲取的人子宮內膜干細胞的組織材料剪碎成3-5mm的細條，用無菌D-hanks溶液洗劑3次；

步驟二：將清洗過的組織置入300mg/ml的Ⅲ膠原酶和40mg/ml的Ⅰ型脫氧核糖核酸酶溶液中，在此消化過程中，始終保持組織浸泡于消化酶中；

步驟三：接著，用恒溫水浴鍋震蕩消化40-60min，得到消化液，消化過程中持續攪動消化組織，避免組織沉到消化液底部；

步驟四：吸取步驟三中的消化液，保留未消化完的組織碎塊，對未消化完的組織碎塊繼續加入300mg/ml的Ⅲ膠原酶和40mg/ml的Ⅰ型脫氧核糖核酸酶溶液中，重復步驟二和步驟三，重復消化一次，吸取消化液，消化液經200-300目的濾網過濾，再經過1200r/min離心，獲得離心消化液，棄去上清，得到細胞組織；

步驟五：用0℃的D-hanks溶液洗劑細胞組織2次，加入DMEM-F12培養基中；

步驟六：將DMEM-F12培養基放入細胞培養箱中培養，培養24～30h后，更換培養基，繼續培養，待細胞密度為70％～80％時，即得到高質量的人子宮內膜干細胞。

3.根據權利要求2所述的一種人子宮內膜干細胞復合修復因子的制備方法，其特征在于：所述的細胞培養箱中的溫度為37℃，細胞培養箱內含有5%的CO₂。

4.根據權利要求1所述的一種人子宮內膜干細胞復合修復因子的制備方法，其特征在于：所述步驟S4中細胞培養上清液的濃縮方法具體步驟為：將收集的干細胞培養上清液采用0.22μm濾膜過濾，然后，再通過25-35KD超濾膜，收集透析液，再將透析液通過90-140D超濾膜，收集截留液，得到人子宮內膜干細胞因子濃縮液，即可。

5.根據權利要求4所述的一種人子宮內膜干細胞復合修復因子的制備方法，其特征在于：所述步驟S4中細胞培養上清液與濃縮后的人子宮內膜干細胞因子濃縮液的體積比為4-2:1。

6.根據權利要求1所述的一種人子宮內膜干細胞復合修復因子的制備方法，其特征在于：所述步驟S5中的冷凍干燥條件為：溫度在-25～-40℃，壓強維持在10-30pa，時間為20-30h，冷凍干燥得到人子宮內膜干細胞凍干粉。

7.根據權利要求1所述的一種人子宮內膜干細胞復合修復因子的制備方法，其特征在于：所述步驟S6中的溶媒由功效原料復配制備而成，功效原料按照體積份數計包括如下組分：超純水60-65份、甲基丙二醇15-20份、玻尿酸3-5份、側柏提取物1-5份、何首烏提取物1-5份、甘油5-15份。

8.根據權利要求7所述的一種人子宮內膜干細胞復合修復因子的制備方法，其特征在于：所述步驟S6中人子宮內膜干細胞凍干粉與溶媒的混合比例為1:1。

9.一種人子宮內膜干細胞復合修復因子的應用，其特征在于：將權利要求1-8任一所述方法制備的人子宮內膜干細胞復合修復因子用于婦科炎癥的改善、子宮內膜的修復、卵巢功能恢復、子宮肌瘤改善婦科方面的臨床應用及產品開發。