[發(fā)明專利]苯丙酮酸脫羧酶突變體M538A在生物發(fā)酵生產(chǎn)苯乙醇中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910688005.0
• 申請(qǐng)日: 2019-07-29
• 公開（公告）號(hào): CN110331173B
• 公開（公告）日: 2020-07-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳守文;占楊楊;王歡;許勇;馬昕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖北大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P7/22
• 分類號(hào): C12P7/22;C12N1/21;C12R1/10
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 龔瑩瑩

本發(fā)明屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域，公開了苯丙酮酸脫羧酶突變體M538A在生物發(fā)酵生產(chǎn)苯乙醇中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)定點(diǎn)突變的方式，將來(lái)源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp.Lactis,其保藏號(hào)為CICC6246)的苯丙酮酸脫羧酶KivD分子催化結(jié)構(gòu)域附近的第538位甲硫氨酸突變?yōu)楸彼犸@著提高了苯丙酮酸脫羧酶的酶活力，解決了目前苯丙酮酸脫羧酶對(duì)苯丙酮酸催化效率不高的問(wèn)題，使用于苯乙醇的生物發(fā)酵，為苯乙醇的生產(chǎn)提供新思路，適合大規(guī)模推廣。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于酶工程和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及苯丙酮酸脫羧酶突變體M538A在生物發(fā)酵生產(chǎn)苯乙醇中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

苯乙醇是一種具有淡雅、細(xì)膩而持久玫瑰花香氣的芳香醇。因其具有的特殊氣味，苯乙醇作為香料物質(zhì)被廣泛應(yīng)用于香水、化妝品以及食品工業(yè)。苯乙醇還可以作為殺蟲劑和新型生物燃料。因此，苯乙醇具有廣泛的應(yīng)用前景。

微生物主要將簡(jiǎn)單的碳源通過(guò)丙酮酮酸途徑和Ehrlich途徑代謝產(chǎn)生苯乙醇。然而只有少數(shù)微生物具有Ehrlich途徑，因此利用微生物合成苯乙醇因菌種種類太少而受到極大限制。酮酸脫羧酶(EC4.1.1.43)是苯乙醇合成途徑中關(guān)鍵酶，復(fù)雜催化苯丙酮酸生成苯丙醛，隨后通過(guò)氧化還原反應(yīng)進(jìn)一步生成終產(chǎn)物苯乙醇。由于其底物作用的高度特異性，苯丙酮酸脫羧酶是苯乙醇生物合成的限速酶。目前，已經(jīng)有研究主要通過(guò)篩選和優(yōu)化表達(dá)酮酸脫羧酶提高其表達(dá)量。目前來(lái)自釀酒酵母酮酸脫羧酶Aro10，畢赤酵母中的酮酸脫羧酶Kdc,腸桿菌酮酸脫羧酶Kdc4427，固氮螺菌酮酸脫羧酶AbPDC和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌脫羧酶PDC和乳酸乳球菌中酮酸脫羧酶KivD被測(cè)試用于苯乙醇的合成，其中來(lái)自酵母菌種的酮酸脫羧酶Aro10是最優(yōu)的酶。在大腸桿菌和釀酒酵母菌中被廣泛應(yīng)用于苯乙醇的合成。但是，這些菌株表達(dá)Aro10仍然存在底物特異性不高產(chǎn)生其他副產(chǎn)物和催化效率低等問(wèn)題，因此，上述技術(shù)均并不能夠真正運(yùn)用于工業(yè)生產(chǎn)。

來(lái)源于乳酸乳球菌中酮酸脫羧酶KivD，是一類具有寬泛底物譜的酮酸脫羧酶，能夠同時(shí)催化支鏈酮酸(3-甲基-2-氧代丁酸，4-甲基-2-氧代戊酸和3-甲基-2-氧代戊酸)，芳香族酮酸(4羥基苯丙酮酸，苯丙酮酸和苯甲酰甲酸)，和直鏈酮酸(2-氧代己酸，2-氧代戊酸和丙酮酸)。通過(guò)酶學(xué)性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，KivD最適合底物為支鏈酮酸中的3-甲基-2-氧代丁酸，用于生成異丁醇。乳酸乳球菌的KivD蛋白結(jié)構(gòu)已被解析，研究人員發(fā)現(xiàn)在催化活性中心附近的461位纈氨酸，268位的絲氨酸，381位的苯丙氨酸，538位的甲硫氨酸和542位的苯丙氨酸對(duì)底物催化發(fā)揮重要的作用。為了獲得相應(yīng)的產(chǎn)物，這5個(gè)位點(diǎn)氨酸酸成為蛋白改造的關(guān)鍵靶標(biāo)。研究人員Peter Lindblad等為了提高異丁醇的產(chǎn)量，提高KivD對(duì)3-甲基-2-氧代丁酸催化活性，對(duì)其中的四個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了系列突變，構(gòu)建了V461I(VI)，V461L(VL)，V461F(VF)，V461A(VA)，M538W(MW)，S286T(ST)，S286Y(SY)，S286A(SA)，F(xiàn)542L(FL)和F542W(FW)突變體。眾多突變體中只有ST和VI的異丁醇產(chǎn)量大幅提高，提高了對(duì)3-甲基-2-氧代丁酸催化活性。James C.Liao課題組為提高3-甲基-1-戊醇的合成，對(duì)KivD進(jìn)行雙位點(diǎn)的疊加突變，構(gòu)建四株突變菌種，分別為V461A/M538A，V461A/M538L，V461A/F381A和V461A/F381L，這四個(gè)突變體中3-甲基-1-戊醇產(chǎn)量比對(duì)照菌株提高了20-50倍，其中V461A/F381L中3-甲基-1-戊醇產(chǎn)量最高，達(dá)到384.3±30.3mg/L。由于對(duì)苯丙酮酸低的底物親和力和催化效率，KivD幾乎不被用于苯乙醇的合成。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供了苯丙酮酸脫羧酶突變體M538A在生物發(fā)酵生產(chǎn)苯乙醇中的應(yīng)用，所述的苯丙酮酸脫羧酶突變體M538A的氨基酸序列為SEQ ID NO.2所示。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：