[發明專利]蛋白激酶Fused編碼基因及其在防治小菜蛾中的應用

有效

• 申請號: 201910683005.1
• 申請日: 2019-07-26
• 公開（公告）號: CN110592044B
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 郭兆將;康師;周君雷;覃艦瑩;龔莉君;孫丹;郭樂;朱流紅;白楊;張竹竹;張友軍
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12N15/113;A01N57/16;A01P7/04
• 代理公司: 北京知本村知識產權代理事務所(普通合伙) 11039
• 代理人: 劉江良

本發明公開了一種昆蟲蛋白激酶，其編碼基因Fused，所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；本發明還公開了Fused基因特異片段，用于dsRNA的合成，該dsRNA注入Bt Cry1Ac殺蟲蛋白敏感和抗性小菜蛾3齡初幼蟲體腔后，小菜蛾生長發育遲緩，并最終導致小菜蛾在幼蟲期和蛹期的死亡。本發明為小菜蛾Bt抗性治理提供了新的靶標，因此具有良好的應用前景。

技術領域

本發明屬于病蟲害防治和生物技術領域，具體涉及小菜蛾蛋白激酶Fused基因及其在小菜蛾防治和Bt抗性治理中的應用。

背景技術

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt）可以產生多種殺蟲晶體蛋白，從而特異性殺死多種田間重大害蟲。基于Bt殺蟲蛋白研發的Bt制劑是目前世界上用量最大的微生物殺蟲劑，而且編碼Bt殺蟲蛋白的多個基因也已經被轉入到多種重要的經濟作物中（簡稱Bt作物），Bt制劑和Bt作物在防治田間害蟲方面發揮了重要作用。然而，Bt制劑大量及不合理的使用以及Bt作物的大面積推廣應用不可避免的導致害蟲快速進化產生了抗藥性，導致田間害蟲防治失敗。在這種背景下，昆蟲Bt抗性分子機制的揭示以及新型害蟲防治技術的研發迫在眉睫。

目前，致力于研發物種特異性生物殺蟲劑和新一代轉基因作物的RNAi的害蟲防治技術被認為是未來田間害蟲防治的希望所在。而且，Bt+RNAi的新一代轉基因作物能有效的延緩田間害蟲的抗性問題，必將在未來田間害蟲防治中發揮關鍵作用。然而，基于Bt+RNAi的新型害蟲防治技術的關鍵在于害蟲高效安全致死靶標基因的篩選。小菜蛾是十字花科作物重要害蟲，全世界每年由小菜蛾危害所造成的直接和間接經濟損失已高達40-50億美元，而我國小菜蛾危害每年引起的經濟損失已高達到7.7億美元，防控難度極大。而且，小菜蛾是第一個也是目前唯一的一個在田間對Bt制劑產生高抗性的害蟲。因此，開展小菜蛾Bt+RNAi高效安全致死靶標基因篩選研究意義重大。

蛋白激酶是催化蛋白質磷酸化的酶，通過催化磷酸轉移至底物蛋白質特定氨基酸殘基上來調控底物蛋白定位以及活性。蛋白激酶是調節細胞功能的關鍵因子，構成了功能最多樣的基因家族之一，依據其被磷酸化的氨基酸殘基種類可分為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、酪氨酸蛋白激酶等。生物體細胞內信號途徑的關鍵基因功能和進化相對比較保守，然而，在基因序列上也會存在物種特異性。而且，我們前期研究發現小菜蛾絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶MAPK信號途徑參與了小菜蛾Bt抗性分子機制。因此，可以尋找功能重要、進化保守且序列存在物種特異性的信號途徑關鍵基因作為小菜蛾RNAi高效安全致死靶標基因。

Fused基因即編碼一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，該基因主要參與生物體刺猬信號途徑(Hedgehog signaling pathway)并在生長發育過程中發揮了關鍵作用，缺失該基因對昆蟲具有致死作用。而且，在不同物種中該基因中間序列不保守。更關鍵的是，在我們前期小菜蛾Bt Cry1Ac殺蟲蛋白敏感和抗性的轉錄組和RNA-Seq研究發現，Fused基因可能在Bt抗性小菜蛾中過表達從而參與小菜蛾Bt抗性。因此，小菜蛾Fused基因可以作為一種潛在的特異性強的新一代Bt+RNAi害蟲防治技術的安全高效靶標基因，從而非常值得開展詳細的研究。

發明內容

利用本發明人實驗室前期完成的Bt Cry1Ac殺蟲蛋白敏感和抗性小菜蛾中腸轉錄組和RNA-Seq數據，發現一個潛在的可能與小菜蛾Bt Cry1Ac殺蟲蛋白抗性相關的上調表達Fused基因。為了驗證該基因是否參與小菜蛾Bt Cry1Ac殺蟲蛋白抗性，首先克隆了Fused基因的全長序列，利用qPCR技術檢測后發現，該基因的表達量在Bt Cry1Ac殺蟲蛋白在抗性小菜蛾中腸中顯著高于敏感小菜蛾，而且隨后的RNAi功能實驗利用特異性dsRNA沉默該基因的表達量能導致小菜蛾對Bt Cry1Ac殺蟲蛋白的敏感性降低，因此，實驗結果證實Fused基因參與小菜蛾Bt Cry1Ac殺蟲蛋白抗性分子機制。