[發明專利]一種玉米雄性不育基因ms54及其功能性分子標記和應用

在審

• 申請號: 201910679604.6
• 申請日: 2019-07-26
• 公開（公告）號: CN110387375A
• 公開（公告）日: 2019-10-29
• 發明（設計）人: 孫偉;蔣鋒;梁思維;姜昊梁;劉鵬飛;張姿麗;陳青春;李小琴;萬小榮
• 申請（專利權）人: 仲愷農業工程學院
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙) 50230
• 代理人: 陳炳萍

1.一種玉米雄性不育基因ms54，其特征在于，所述玉米雄性不育基因ms54的序列為：SEQ ID NO：1。

2.一種包含權利要求1所述玉米雄性不育基因ms54的功能性分子標記，標記引物序列分別為ms54-F:5'-GGTCACACTTATCATTCCTC-3'；ms54-R：5'-ATCTACCAGTCTACCACAGC-3'，擴增片段長度為345bp，Tm為56℃。

3.一種如權利要求1所述玉米雄性不育基因ms54在控制玉米小孢子發育及花粉育性中的應用。

4.一種使用權利要求1所述玉米雄性不育基因ms54控制玉米小孢子發育及花粉育性的測定方法，其特征在于，所述玉米雄性不育基因ms54控制玉米小孢子發育及花粉育性的測定方法包括以下步驟：

第一步，突變體雄性不育突變體表型鑒定；

第二步，組織細胞學分析突變體花藥發育缺陷；

第三步，候選基因Ms54的圖位克隆；

第四步，qRT-PCR和原位雜交分析Ms54表達模式；

第五步，Ms54等位性測驗。

5.如權利要求4所述的玉米雄性不育基因ms54控制玉米小孢子發育及花粉育性的測定方法，其特征在于，所述突變體雄性不育突變體表型鑒定包括：選取等量的Ye478^F和Ye478^S種子，分別種植用于突變體表型的鑒定；調查要性狀包括：株高、葉片長寬和生育期農藝性狀；穗長、穗粗、穗行數、行粒數和穗重產量相關性狀；雄穗分枝數、小花數目和花粉育性；

將Ye478^S分別與優良自交系雜交，觀察F₂后代性狀分離情況，分析等位基因效應，確定其控制雄性不育性狀的特點；

所述組織細胞學分析突變體花藥發育缺陷包括：分別選取Ye478^F和Ye478^S植株的不同發育階段的花藥組織用4％的多聚甲醛進行固定；利用特異的核酸染料對各發育階段的花藥進行染色體行為鑒定；將固定好的花藥組織進行石蠟包埋并制備成8mm厚的切片；用0.05％的甲苯胺藍進行染色后觀察小孢子發育過程和花藥壁發育特點以及突變體發育過程中的缺陷。

6.如權利要求4所述的玉米雄性不育基因ms54控制玉米小孢子發育及花粉育性的測定方法，其特征在于，所述候選基因Ms54的圖位克隆包括：通過構建兩個F₂分離群體進行突變體候選基因的圖位克隆；其中，Ye478^Sx Ye478^FF2群體用于初定位，采用BSA的方法對玉米全基因組1000對SSR標記進行篩選，獲得共分離的標記；Ye478^Sx B73 F₂群體單株數目為915株，用于候選基因的精細定位。

7.如權利要求4所述的玉米雄性不育基因ms54控制玉米小孢子發育及花粉育性的測定方法，其特征在于，所述qRT-PCR和原位雜交分析Ms54表達模式包括：選取Ye478^F和Ye478^S不同發育時期的組織器官，包括幼根、幼葉、成熟葉、節間、幼嫩的雌雄穗以及不同發育階段的花藥，利用Trizol試劑提取中RNA，通過RT-PCR和qRT-PCR技術分析Ms54基因的時空表達模式，并比較野生型和突變體中Ms54基因的時空表達差異；利用特異的引物進行Ms54基因mRNA探針的擴增和轉錄，然后在不同發育階段的花藥組織切片中進行雜交，分析該基因在花藥發育過程中的表達趨勢以及不同細胞結構中的分布特點，同時比較分析野生型和突變體中的表達和分布差異。

8.一種如權利要求1所述玉米雄性不育基因ms54在玉米花藥雄性不育突變體圖位克隆及等位測定中的應用。