[發(fā)明專利]一種用于檢測SFTPB基因突變的引物組、試劑盒及其擴增方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910675765.8
• 申請日: 2019-07-25
• 公開（公告）號: CN110358823A
• 公開（公告）日: 2019-10-22
• 發(fā)明（設計）人: 孫德俊;徐桂華;王瀟;高笑宇;李媛
• 申請（專利權）人: 內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京權智天下知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11638
• 代理人: 王新愛

本發(fā)明公開了一種用于檢測SFTPB基因突變的引物組、試劑盒以及擴增方法，該引物組包括PCR擴增引物組和測序引物組；該試劑盒包括所述引物組，該試劑盒還包括PCR擴增試劑、PCR產(chǎn)物純化試劑和DNA測序試劑；該擴增方法包括兩個階段：(1)第一階段反應：95℃預變性2min；94℃變性20s，起始溫度為64℃退火40s，每個循環(huán)遞減0.5℃，72℃延伸1min，完成11個循環(huán)；(2)第二階段反應：94℃變性20s，58℃退火30s，72℃延伸1min，完成24個循環(huán)；72℃延伸2min；本發(fā)明可以特異性地鑒別SFTPB基因是否突變，確保測定結果的準確性和唯一性；可以用于慢阻肺的疾病診斷，同時還可以用于研究SFTPB SNP位點與基因功能之間關系；能大幅度提高PCR的特異性和效率，從擴增到測序過程簡單易操作，耗時少。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術和醫(yī)學研究應用領域，主要內(nèi)容為檢測慢阻肺發(fā)生發(fā)展相關基因SFTPB基因突變，具體涉及用于檢測SFTPB基因突變的引物組，包括擴增引物組和測序引物組，還涉及兩種引物組在PCR擴增獲得核酸樣品中發(fā)揮的用途，PCR擴增反應體系和條件，以及包含該引物組的試劑盒，特別涉及一種用于檢測SFTPB基因突變的引物組、試劑盒及其擴增方法。

背景技術

慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)是一種持續(xù)存在的、以呼吸道癥狀和氣流受限為特征的、可防治的常見呼吸道疾病，通常由有害顆粒或氣體暴露所引起的氣道和(或)肺泡異常導致。早期主要表現(xiàn)為慢性咳嗽、咳痰、氣短、胸悶或呼吸困難，隨疾病進展，患者逐漸出現(xiàn)食欲減退、外周肌肉萎縮、焦慮抑郁等并發(fā)癥。2015年，全球疾病負擔研究(GlobalBurden of Diseases,Injuries,and Risk Factors，GBD)顯示，全球慢阻肺人數(shù)已達174500萬，死亡人數(shù)為320萬，其患病率僅達哮喘1/2，死亡率卻是哮喘8 倍以上，預計截至到2030年，慢阻肺會成為世界第三常見死亡病因。我國最新的一項流行病學調(diào)查研究顯示，我國20歲以上成人慢阻肺患病人數(shù)為 9990萬，約1億，患病率已達到8.6％。雖然慢阻肺的氣流受限呈進行性發(fā)展，不可逆轉(zhuǎn)，但慢阻肺是可以預防、控制的，提高對慢阻肺危險因素的認識，采取有效的防控措施，有可能降低其發(fā)病率、死亡率，減少并發(fā)癥的發(fā)生。已有大量文獻報道，吸煙是慢阻肺重要的環(huán)境危險因素，幾乎90％慢阻肺患者是吸煙人群，但是僅有10％-15％的小部分吸煙人群才會發(fā)展為臨床癥狀顯著的慢阻肺。即使是重度吸煙者，慢阻肺的發(fā)病率還不到50％。因此，吸煙引起的慢阻肺易感性存在個體差異。另有研究發(fā)現(xiàn)，有慢阻肺家族史的人群，患慢阻肺的風險性是無慢阻肺家族史人群的2.08倍，且家族中患有慢阻肺的人數(shù)越多，其他成員患慢阻肺的風險性就越大，表明遺傳因素在慢阻肺的易感性中具有重要作用。盡管大量研究已經(jīng)開展并證明了遺傳因素的重要性，但是也尚未能明確確定導致慢阻肺發(fā)生發(fā)展的遺傳因素。目前，α1抗胰蛋白酶的基因SERPINA1突變是唯一已確定的與慢阻肺相關的遺傳風險因素，但是該基因上的致病突變在非洲和亞洲群體中小于0.004％，只能解釋約2％的慢阻肺患者。近年來，基因組關聯(lián)分析被廣泛應用和開展，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了許多與慢阻肺發(fā)生相關的易感基因。

SFTPB(surfactant protein B，肺表面活性蛋白B)是一種疏水性的小分子肺表面活性蛋白，是肺泡表面活性物質(zhì)中的重要成分，分布于肺泡、氣管和各級支氣管中，具有降低肺泡表面張力、促進氣道液體清除、維持肺泡和氣道穩(wěn)定性的作用。SFTPB基因位于人類2號染色體短臂上，其等位基因具有多態(tài)性，突變概率為百萬分之三。位于SFTPB基因啟動子Promoter、5'UTR(5側(cè)翼非翻譯區(qū))、3'UTR(3側(cè)翼非翻譯區(qū))、內(nèi)含子和編碼區(qū)域的多個單核苷酸多態(tài)性位點，被認為是潛在影響SFTPB功能的位點。但是，主要突變分布在前9個外顯子上，其中發(fā)生在第2、4、7外顯子上的突變尤為明顯。我們前期研究采集434例慢阻肺患者和335例健康對照患者的血液樣本，通過病例對照研究，采用SNP分型技術檢測SFTPB 基因rs1130866和rs2118177位點多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)rs1130866位點與慢阻肺的發(fā)生相關，且T等位基因是慢阻肺的保護因素，而rs1130866位點位于SFTPB 基因的第4外顯子上。關于墨西哥和德國人群的研究也發(fā)現(xiàn)SFTPB基因多態(tài)性與慢阻肺易感性相關。