[發明專利]CRISPR多靶標檢測方法及其試劑盒

在審

• 申請號: 201910673246.8
• 申請日: 2019-07-24
• 公開（公告）號: CN112301101A
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 李詩淵;王金
• 申請（專利權）人: 上海吐露港生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 徐迅;崔佳佳

本發明涉及CRISPR多靶標檢測方法及其試劑盒。具體地，本發明提供了一種利用CRISPR方法快速檢測多靶標的方法和試劑盒。具體地，本發明提供了一種用于檢測靶標核酸分子的檢測體系，包含：(a)n種具有特定結構的向導RNA?報告核酸復合探針；和(b)Cas蛋白，所述Cas蛋白是具有旁路單鏈核酸切割活性的Cas蛋白。使用本發明所提供的方法，可以同時、快速、準確地檢測出同一樣本體系中所含有的不同靶標核酸分子。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地說，本發明涉及CRISPR多靶標檢測方法及其試劑盒。

背景技術

利用Cas13或Cas12蛋白的CRISPR診斷方法被譽為下一代檢測技術(分別稱為SHERLOCK和HOLMES)，因其同時兼具快速、靈敏、特異、簡便和廉價的特點。Cas12和Cas13蛋白能用于核酸檢測是基于它們旁路(或反式)切割的活力，即在人工設計的向導RNA的引導下，結合特定序列的核酸片段，隨之切割單鏈核酸探針，從而產生可被檢測的信號。Cas12和Cas13的差異在于，Cas13蛋白結合RNA標靶并切割RNA探針，而Cas12則結合DNA靶標并切割單鏈DNA探針。

從原理上來說，若使用Cas13來檢測常規的DNA靶標，對靶標DNA進行擴增，并在此過程中引入T7等啟動子序列；然后還需要進行體外轉錄以生成模板RNA，以便Cas13進行識別和結合。此外，在Cas13的檢測過程中所使用的RNA報告探針存在較大風險被RNA酶降解，從而導致檢測體系的背景信號值較高。相比之下，基于Cas12的檢測方法由于無需體外轉錄也不需要RNA報告探針，因而更具優勢。

在一個檢測體系中同時檢測多個存在靶標的方法和技術對于體外診斷的拓展應用非常重要。目前，基于Cas13蛋白已開發出一種多靶標檢測的方法，其關鍵是利用不同物種來源的Cas13蛋白針對不同RNA報告探針的旁路切割活性不同的特點。然而，Cas12沒有這方面特性的研究報導；因此，有必要開發一種全新的方法，利用Cas蛋白進行多靶標核酸的檢測。

發明內容

本發明的目的就是提供一種基于CRISPR-Cas蛋白的多靶標檢測方法和試劑盒。

在本發明的第一方面，提供了一種用于檢測靶標核酸分子的檢測體系，所述檢測體系包含：

(a)n種向導RNA-報告核酸復合探針，所述的向導RNA-報告核酸復合探針具有如式Ia、Ib、Ic或Id所示結構，

Z1-Z2-Z3-Z4-Z5 (式Ia)

Z5-Z4-Z3-Z2-Z1 (式Ic)

其中，

Z1為第一莖環結構區；

Z2為無或核酸連接區；

Z3為向導RNA區；

Z5為帶可檢測標記的單鏈待切割核酸，其中，所述的可檢測標記在所述單鏈待切割核酸被切割和未被切割的情況下，呈現不同的檢測狀態從而被檢測出；

其中，當靶標核酸不存在于所述檢測體系時，Z3與Z5形成一互補配對的雙鏈結構區；而當靶標核酸存在于所述檢測體系時，Z3與Z5不形成所述的互補配對的雙鏈結構區；

Z4為無、或用于連接Z3和Z5的化學鍵或連接區；

為堿基互補配對的氫鍵；

并且，n為n≥1的正整數；和

(b)Cas蛋白，所述Cas蛋白是具有旁路單鏈核酸切割活性的Cas蛋白。

在另一優選例中，所述的Cas蛋白選自下組：Cas12型、Cas13a型、Cas13b型、Cas14型、或其組合。