[發(fā)明專利]靶向CD133的結(jié)合蛋白及其應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2019-07-24
• 公開（公告）號: CN110407924B
• 公開（公告）日: 2021-12-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 魏星;陳柔
• 申請（專利權(quán)）人: 暨南大學
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/12;C12N15/70;A61K38/17;A61P35/00
• 代理公司: 廣州市華學知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞

本發(fā)明公開了一種靶向CD133的結(jié)合蛋白及其應(yīng)用。本發(fā)明從人源蛋白文庫，利用噬菌體展示技術(shù)篩選與CD133胞外段結(jié)合的蛋白，最終篩選出7個結(jié)合蛋白；將這7個結(jié)合蛋白基因擴增，測序，并克隆至表達載體，進行結(jié)合蛋白原核系統(tǒng)表達純化，隨后進行ELISA檢測、MTT、細胞凋亡、Transwell侵襲實驗，結(jié)果顯示7個結(jié)合蛋白與抗原結(jié)合能力較強，能有效地抑制腫瘤細胞增殖、侵襲，并能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。本發(fā)明所提供的蛋白為全人源化結(jié)合蛋白，應(yīng)用在人體內(nèi)不會產(chǎn)生免疫原性，且在體外具有抑制腫瘤細胞的作用。這7個結(jié)合蛋白可為后期開發(fā)腫瘤蛋白藥物奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及結(jié)合蛋白領(lǐng)域，特別涉及一種靶向CD133的結(jié)合蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

腫瘤細胞具有的不死性、遷移性和失去接觸抑制的特點，使得腫瘤成為人類極難治愈的疾病之一。目前腫瘤治療手段主要有手術(shù)切除，放療或者化療，但在腫瘤中的存在一群具有類似干細胞特性的腫瘤干細胞導(dǎo)致治療后腫瘤復(fù)發(fā)率極高。2006年，美國癌癥研究協(xié)會將腫瘤干細胞定義為：腫瘤中具有自我更新能力并能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細胞的細胞。這種細胞在體內(nèi)可以長期處于休眠狀態(tài)，并具有多種耐藥分子而對殺傷腫瘤細胞的外界理化因素不敏感，導(dǎo)致在常規(guī)腫瘤治療方法消滅大部分普通腫瘤細胞后，腫瘤再次復(fù)發(fā)。基于腫瘤干細胞的特性，通過基因工程技術(shù)開發(fā)靶向腫瘤干細胞表面特異性標記分子的蛋白，或許將成為治療癌癥的新曙光。

作為干細胞及腫瘤干細胞表面特異性標記蛋白之一，CD133最早是Yin等從CD34造血干細胞中通過人工AC133單克隆抗體分離而來。CDl33屬于Prominin家族成員之一，基因定于位于人的4號染色體，大小約152kb，包含至少37個外顯子。CD133蛋白由865個氨基酸組成，分子量約120kDa，包含：細胞外NH₂-端，5次跨膜結(jié)構(gòu)域，2個胞外環(huán)狀結(jié)構(gòu)，2個富含半胱氨酸的胞內(nèi)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，胞內(nèi)-COOH結(jié)構(gòu)。已有研究表明，CD133是一種造血干細胞和神經(jīng)干細胞的表面標志物；在腦膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、惡性黑色素瘤等腫瘤的腫瘤干細胞中CD133均有表達，并且在腦腫瘤、乳腺癌和結(jié)腸癌中，CD133⁺細胞比CD133^-細胞成瘤性強；通過基因芯片和臨床分析發(fā)現(xiàn)，CDl33⁺腫瘤細胞表現(xiàn)出更強的增殖能力，并且預(yù)后較差。以上研究結(jié)果均表明，CDl33在腫瘤干細胞中的表達對癌癥的發(fā)展具有重要意義。因此，可將CD133作為開發(fā)抗腫瘤藥物的新靶點。

與傳統(tǒng)的單克隆抗體相比，僅由一個重鏈可變區(qū)組成的結(jié)合蛋白具有分子量小，易于穿過血腦屏障，免疫原性低，特異性強等優(yōu)點。已有相關(guān)研究結(jié)果表明，結(jié)合蛋白可有效地靶向抗原，且在體內(nèi)外均具有抗腫瘤效果。目前，還沒有關(guān)于與腫瘤干細胞標記蛋白CD133結(jié)合的蛋白的研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種靶向腫瘤干細胞標志分子CD133的結(jié)合蛋白。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述的靶向CD133的結(jié)合蛋白的制備方法。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述的靶向CD133的結(jié)合蛋白的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種靶向CD133的結(jié)合蛋白，是CD133-2B1蛋白、CD133-2C4蛋白、CD133-2C10蛋白、CD133-3B4蛋白、CD133-3B12蛋白、CD133-4B9蛋白和CD133-4B12蛋白中的一種或至少兩種組合形成的結(jié)合蛋白；所述的靶向CD133的結(jié)合蛋白由1個重鏈可變區(qū)組成；

所述的CD133-2B1蛋白的氨基酸序列如下(亦如SEQ ID NO.1所示)：

MAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYKITAEFMGWVRQAPGKGLEWVSTISRHSGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAASVGKFPWVWVSEATVNYWGQGTLVTVSSAAA；