[發(fā)明專利]一種褐藻膠裂解酶及其應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201910671029.5
• 申請日: 2019-07-24
• 公開（公告）號: CN110438111A
• 公開（公告）日: 2019-11-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 江波;劉曉勇;張濤;孟青;陳靜靜;王心怡
• 申請（專利權(quán)）人: 山東海之寶海洋科技有限公司
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N1/20;C12P19/00;C12R1/63
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發(fā)明公開了一種褐藻膠裂解酶及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的褐藻膠裂解酶降解活性高，酶活達(dá)65U/mg；性質(zhì)穩(wěn)定，于4℃儲存18個月后酶活仍保持初始酶活的98％以上；具有很高的產(chǎn)物特異性，可特異性生產(chǎn)褐藻寡糖三糖。本發(fā)明所得褐藻膠裂解酶具有重要的工業(yè)應(yīng)用價值和科學(xué)研究價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種褐藻膠裂解酶及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

褐藻膠(Alginate)是由β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronate)和α-L-古羅糖醛酸(α-L-guluronate)兩種糖單元通過1，4糖苷鍵聚合而成的線性多糖，我國是世界上最大的褐 藻膠生產(chǎn)國家，生產(chǎn)量超過總產(chǎn)量的70％。褐藻寡糖(Alginate Oligosaccharides,AOS)是褐 藻膠的降解產(chǎn)物，含有2-20個糖單位，分子量小，能克服褐藻膠大分子不能穿過機(jī)體各種生 物屏障的限制，應(yīng)用范圍更廣，能顯示出比褐藻膠多糖更為卓越的生物活性，如抗凝血、降 低血糖血脂、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用，還能促進(jìn)雙歧桿菌等有益微生物的 生長。

酶解反應(yīng)具備條件易控制、底物特異性強(qiáng)、產(chǎn)率高、節(jié)能環(huán)保等諸多優(yōu)勢，已成為目前 制備褐藻寡糖(AOS)的主要途徑。以褐藻膠為原料酶解制備AOS主要是通過褐藻膠裂解酶 的作用實現(xiàn)的，即通過β-消除反應(yīng)斷裂褐藻膠多糖糖苷鍵，并產(chǎn)生在新生成的非還原端C4,5 間形成不飽和雙鍵結(jié)構(gòu)的寡糖產(chǎn)物。

褐藻膠裂解酶屬于多糖裂解酶家族(EC 4.2.2)，按其對底物的降解方式不同分為聚 β-D-1,4-甘露糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.3)和聚α-L-1,4-古羅糖醛酸裂解酶(EC4.2.2.11)。褐藻 膠裂解酶來源廣泛，主要來源于海藻類植物、海洋細(xì)菌、真菌和軟體動物等，然而目前酶制 劑種類少且價格昂貴，限制了該酶的應(yīng)用發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種新型褐藻膠裂解酶Aly01，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；編碼該 褐藻膠裂解酶的基因的核苷酸序列可以如SEQ ID NO:2所示，其中1～78bp編碼信號肽。

本發(fā)明還提供一種利用需鈉弧菌SK42.001生產(chǎn)新型褐藻膠裂解酶Aly01的方法，包括以 下步驟：

(1)種子培養(yǎng)：種子培養(yǎng)基：海藻酸鈉5，(NH₄)₂SO₄ 5，NaCl 30，MgS0₄·7H₂O 1，K₂HPO₄ 2，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01；將需鈉弧菌SK42.001接入種子培養(yǎng)基，于28℃、200rpm搖床培養(yǎng)12 h；

(2)發(fā)酵培養(yǎng)：發(fā)酵培養(yǎng)基：海藻酸鈉8，NH₄Cl 5，NaCl 30，MgS0₄·7H₂O 1，K₂HPO₄2，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01；發(fā)酵條件為：接種量5％、溫度28℃、轉(zhuǎn)速200rpm發(fā)酵36h，得到含 有褐藻膠裂解酶的發(fā)酵液；

(3)純化：將發(fā)酵液離心除掉菌體得到褐藻膠裂解酶粗酶液，經(jīng)20％～80％硫酸銨分離 沉淀目的蛋白、緩沖液透析、DEAE-FF 16/10離子交換層析、Superdex 75凝膠過濾層析，最 后將純化后的Aly01純酶液體，冷凍干燥得到酶粉。

本發(fā)明還提供利用新型褐藻膠裂解酶Aly01特異性生產(chǎn)褐藻寡糖三糖的方法，以海藻酸 鈉為底物，以NaCl為酶穩(wěn)定劑，在pH6.5-9的緩沖體系中降解海藻酸鈉合成褐藻寡糖三糖。 所述NaCl穩(wěn)定劑的用量優(yōu)選100mM以上。所述方法優(yōu)選在25～40℃條件下進(jìn)行，尤其是 35℃。

本發(fā)明的有益效果：