[發(fā)明專利]一種適用于聚球藻的生物封存系統(tǒng)、構(gòu)建方法及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910668051.4
• 申請(qǐng)日: 2019-07-23
• 公開（公告）號(hào): CN110438053B
• 公開（公告）日: 2022-03-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳磊;周宇晴;孫韜;陳子熙;宋馨宇;張衛(wèi)文
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/74;C12R1/01
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 曹玉平

本發(fā)明公開了一種適用于聚球藻的生物封存系統(tǒng)、構(gòu)建方法及應(yīng)用，構(gòu)建為：從聚球藻7942中獲得毒性基因sepT2、抗毒基因sepA2及缺鐵誘導(dǎo)啟動(dòng)子PisiAB，從集胞藻6803中獲得啟動(dòng)子PpsbA2；從整合型質(zhì)粒pBA3031中擴(kuò)增得到終止子Trbcl；以pBR322為載體，用缺鐵誘導(dǎo)啟動(dòng)子PisiAB表達(dá)毒性基因sepT2，用終止子Trbcl終止轉(zhuǎn)錄；用啟動(dòng)子PpsbA2表達(dá)抗毒基因sepA2，構(gòu)建質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入聚球藻。本發(fā)明的系統(tǒng)，在非誘導(dǎo)情況下正常生長(zhǎng)，誘導(dǎo)后迅速死亡。這對(duì)聚球藻的生物封存系統(tǒng)發(fā)展與優(yōu)化具有重要的理論及實(shí)際意義，也為解決其它藍(lán)細(xì)菌的生物安全問題提供了借鑒。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物安全領(lǐng)域，具體涉及一種適用于聚球藻7942和聚球藻2973的生物封存系統(tǒng)、其構(gòu)建方法及應(yīng)用，可用于防止基因工程菌的逃逸。

背景技術(shù)

隨著傳統(tǒng)能源日益枯竭、溫室效應(yīng)逐漸嚴(yán)重、環(huán)境不斷惡化等問題，生物能源因其綠色環(huán)保可持續(xù)等特點(diǎn)越來越受到人們的廣泛關(guān)注，開發(fā)利用可替代的新能源迫在眉睫。聚球藻作為一種光合藍(lán)細(xì)菌，可直接利用光能和二氧化碳生產(chǎn)生物燃料和精細(xì)化學(xué)品，近年來已作為新一代“細(xì)胞工廠”得到了廣泛應(yīng)用。聚球藻7942是常用的模式菌株，遺傳背景清晰，而聚球藻2973由于其耐高光、耐高溫、快速生長(zhǎng)的特點(diǎn)，成為了極具生產(chǎn)潛力的工程菌。但由于藍(lán)細(xì)菌在自然環(huán)境中具有很強(qiáng)的適應(yīng)性和繁殖力，且很多藍(lán)細(xì)菌是天然感受態(tài)，外源基因可通過基因水平轉(zhuǎn)移擴(kuò)散到天然藍(lán)藻中，因此潛在的生物安全問題也引起了大眾關(guān)心：如外源基因逃逸極其可能帶來的基因庫污染，基因編輯菌株對(duì)生物多樣性的影響等。

為了解決這一問題，主動(dòng)型和被動(dòng)型的生物封存系統(tǒng)在藍(lán)細(xì)菌中都已經(jīng)得到了開發(fā)。現(xiàn)存的主動(dòng)型致死系統(tǒng)通常是組合誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和致死基因，但由于啟動(dòng)子的嚴(yán)謹(jǐn)性等限制，會(huì)造成未經(jīng)誘導(dǎo)的菌株生長(zhǎng)受到影響。而被動(dòng)型系統(tǒng)是基于通過敲除特定基因來生產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，但因“饑餓”造成菌株死亡往往需要很長(zhǎng)的時(shí)間。因此，開發(fā)一種適用于聚球藻7942和聚球藻2973的嚴(yán)謹(jǐn)、高效、可快速致死的生物封存系統(tǒng)至關(guān)重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種適用于聚球藻的生物封存系統(tǒng)。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種適用于聚球藻的生物封存系統(tǒng)的構(gòu)建方法。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種適用于聚球藻的生物封存系統(tǒng)的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

適用于聚球藻的生物封存系統(tǒng)的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)從聚球藻7942中獲得毒性基因sepT2、抗毒基因sepA2以及缺鐵誘導(dǎo)啟動(dòng)子PisiAB，從集胞藻6803中獲得啟動(dòng)子PpsbA2；從整合型質(zhì)粒pBA3031中擴(kuò)增得到終止子Trbcl；所述毒性基因sepT2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述抗毒基因sepA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述缺鐵誘導(dǎo)啟動(dòng)子PisiAB的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述啟動(dòng)子PpsbA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述終止子Trbcl的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

(2)以pBR322為載體，用缺鐵誘導(dǎo)啟動(dòng)子PisiAB表達(dá)毒性基因sepT2，用終止子Trbcl終止轉(zhuǎn)錄；用啟動(dòng)子PpsbA2表達(dá)抗毒基因sepA2，構(gòu)建質(zhì)粒pBR322-A2/T2；

(3)將所述質(zhì)粒pBR322-A2/T2轉(zhuǎn)入聚球藻。

步驟(3)所述聚球藻優(yōu)選為聚球藻7942或聚球藻2973。

上述方法構(gòu)建的適用于聚球藻的生物封存系統(tǒng)。

上述系統(tǒng)的應(yīng)用。

本發(fā)明的適用于聚球藻的生物封存系統(tǒng)，在非誘導(dǎo)情況下正常生長(zhǎng)，誘導(dǎo)后迅速死亡。這對(duì)聚球藻的生物封存系統(tǒng)發(fā)展與優(yōu)化具有重要的理論及實(shí)際意義，也為解決其它藍(lán)細(xì)菌的生物安全問題提供了借鑒。