[發(fā)明專利]蘭屬植物SSR引物，及其在居群遺傳多樣性分析中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910659929.8
• 申請日: 2019-07-22
• 公開（公告）號: CN110423747B
• 公開（公告）日: 2023-01-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李政;李志能;寇帥;眭順照;李名揚;李先源
• 申請（專利權(quán)）人: 西南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6895
• 代理公司: 北京智為時代知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11498
• 代理人: 王加嶺;楊靜

本發(fā)明采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)在蘭花植物中開發(fā)并篩選具有特異性強、多態(tài)性高的SSR引物，利用篩選出的引物對采集到的來自9個居群的120株蘭花基因組DNA進行檢測從而分析其遺傳多樣性以及居群遺傳特性。利用磁珠富集法獲得91條具有SSR的DNA序列，并成功設(shè)計了72對引物用于多態(tài)性引物的篩選，最終篩選出8對擴增穩(wěn)定、特異性強、多態(tài)性高的引物。本發(fā)明從分子和形態(tài)學(xué)層面對蘭花的遺傳多樣性進行分析，揭示蘭花遺傳分化的主要來源，并對在渝貴川采集的9個野生蘭花居群進行聚類分析，以此來說明地理位置對蘭花居群遺傳分化的影響。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子標(biāo)記領(lǐng)域，具體地說，涉及蘭屬植物SSR標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

SSR也被稱為STMS、SSRP，是一種微衛(wèi)星標(biāo)記。該技術(shù)也是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的，因其需要提前知道樣本DNA序列，因此根據(jù)序列設(shè)計出的引物具有非常強的特異性。微衛(wèi)星側(cè)翼序列保守，通過PCR擴增后，并通過瓊脂糖凝膠電泳或者聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物以檢測多態(tài)性。SSR標(biāo)記的優(yōu)點：(1)SSR技術(shù)是共顯性標(biāo)記，能夠區(qū)分雜合子、純合子，可獲得較多信息；(2)多態(tài)性高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性強。缺點是實驗成本高，耗時長，需要大量的人力物力，這也是限制SSR標(biāo)記發(fā)展的一個重要原因。雖然SSR標(biāo)記技術(shù)耗時費力，但因其極高的特異性而廣受研究者的歡迎。劉艷麗將SSR分子標(biāo)記應(yīng)用到鑒別中草藥偽品的研究中，SSR的長度差異以及等位基因數(shù)目的變化會顯示出偽品與正品之間的差異。徐禮羿等采用SSR標(biāo)記技術(shù)評估了大葉種茶樹的遺傳多樣性以及居群結(jié)構(gòu)，構(gòu)想了大葉種茶樹居群可能的來源。

SSR標(biāo)記普遍并廣泛存在于植物基因組DNA中，因其重復(fù)單元的長度、數(shù)量等存在多態(tài)性，因此可以利用這種特性根據(jù)SSR序列兩翼的保守序列設(shè)計引物，采用PCR技術(shù)在植物基因組DNA中擴增出具有多態(tài)性的DNA序列片段。SSR標(biāo)記引物具有特異性，因此必須提前獲取所研究植物的基因組序列，利用SSR標(biāo)記搜索工具找到相對應(yīng)的SSR標(biāo)記，才能夠設(shè)計出成對的具有特異性的SSR引物，因此SSR標(biāo)記的開發(fā)是SSR分子標(biāo)記技術(shù)的難點。由郭大龍對開發(fā)SSR標(biāo)記的方法總結(jié)歸納得出：(1)從公共的DNA序列數(shù)據(jù)庫或者已經(jīng)發(fā)表過的文章中獲取SSR兩翼的保守序列和引物，這種方法最省時省力，也大大縮小了經(jīng)濟成本，但是由于物種基因組信息的缺乏，已獲得的序列信息并不能滿足SSR引物設(shè)計的需求，因此此方法不具有長遠性。(2)相同標(biāo)記實現(xiàn)物種間共用。如在大豆、水稻中獲得的專一性SSR引物同樣可以應(yīng)用于柑橘屬、蕓薹屬、獼猴桃屬。但目前仍沒有確定微衛(wèi)星引物在不同類群中推廣的標(biāo)準(zhǔn)。(3)構(gòu)建基因文庫。此方法技術(shù)路線成熟，并且在開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記中使用最多的方法。此方法是提前獲知基因組信息的前提下與含有SSR的生物素化的探針雜交，檢測陽性克隆具體基因序列，根據(jù)搜索到的SSR標(biāo)記的兩翼保守序列設(shè)計特異性引物。此方法微衛(wèi)星引物獲得的效率低，但是操作簡單，易于理解，是開發(fā)微衛(wèi)星引物的經(jīng)典方法。(4)富集法，即建立微衛(wèi)星富集文庫從而提高陽性克隆的獲得率。此方法可分為兩種，一種是引物富集法，即利用含有SSR的引物進行微衛(wèi)星富集；另一種是雜交富集法，即利用含SSR的探針進行微衛(wèi)星富集。近些年來，采用雜交富集法開發(fā)微衛(wèi)星引物的研究頗多，該方法又分為尼龍膜法和磁珠富集法，尼龍膜法是利用吸附在尼龍膜上的微衛(wèi)星探針來富集基因組DNA中的微衛(wèi)星序列，洗脫富集到的片段，進行PCR擴增，連接載體并轉(zhuǎn)入到大腸桿菌，從而挑取陽性克隆進行測序；相比之下，磁珠富集法更受廣大研究者的青睞，此方法是先用生物素標(biāo)記的重復(fù)序列的探針與經(jīng)過酶切后的基因組DNA雜交，因生物素與鏈霉親和素有較強的親和性，因此利用含有鏈霉親和素的磁珠與雜交液充分混合，從而利用磁力將含重復(fù)序列的目標(biāo)片段進行富集，從而大大提高了重復(fù)序列片段的獲得率。富貴等采用磁珠富集法開發(fā)微衛(wèi)星片段，共獲得陽性克隆克隆236個，選取其中80個進行測序，其中68條序列為唯一序列，選擇40條含有SSR位點的序列成功設(shè)計出40對引物，經(jīng)過篩選，最終獲得了20對擴增穩(wěn)定、多態(tài)性高的引物，成功率達到50％。王久利等在開發(fā)青藏高原特有珍貴植物西川紅景天(Rhodiolaalsia)微衛(wèi)星標(biāo)記的研究中利用FIASCO磁珠富集法共獲得2500個陽性克隆，隨機挑選其中200個陽性克隆進行測序，獲得105個含有微衛(wèi)星位點的序列，并成功設(shè)計引物105對，經(jīng)篩選獲得了13對多態(tài)性高、穩(wěn)定性強的引物，并利用這些引物對西川紅景天的居群結(jié)構(gòu)進行了進一步研究。(5)省略篩庫法，這種方法不需要刻意篩選含SSR的克隆，所獲得的SSR在轉(zhuǎn)化成特異性標(biāo)記時，只需合成一個特異引物，結(jié)合已有的錨定引物就可以檢測基因組中對應(yīng)的SSR了。這種方法主要有兩種：STMP法和SAM法。這兩種方法雖然提高了開發(fā)SSR標(biāo)記的效率，但是操作復(fù)雜繁瑣。在實際操作過程中如何選擇微衛(wèi)星引物開發(fā)方法，需要根據(jù)課題的研究方向以及實驗室條件來選擇。