[發明專利]鑒別檢測裂谷熱病毒的雙重熒光定量RT-PCR引物及探針

在審

• 申請號: 201910654233.6
• 申請日: 2019-07-19
• 公開（公告）號: CN110295254A
• 公開（公告）日: 2019-10-01
• 發明（設計）人: 楊蕾蕾;李文良;毛立;郝飛;李基棕;張紋紋;江杰元;孫敏;劉茂軍
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 程斯佳

1.一種鑒別檢測裂谷熱病毒的雙重熒光定量RT-PCR引物及探針，其特征在于，所述檢測裂谷熱病毒的通用檢測引物及探針的序列分別為：

上游引物L-F：5’-TGACATACAAGGAGCATCTGAAA-3’；

下游引物L-R：5’-GCCAAAGGTGAAATCGTGAAC-3’；

熒光探針L-P：5’–JOE-AGGCTCAACTTTGCTACCCTCCAT-TAMRA-3’；

檢測裂谷熱病毒非基因缺失株的特異性檢測引物及探針的序列分別為：

上游引物S-F：5’-AGGATGATAGTGACCGAGGCT-3’；

下游引物S-R：5’-AATGAGGGCTGAGTTTGGAA-3’；

熒光探針S-P：5’–FAM-CCTCAGAGGGATTGACCTGTGCCTGTTGCCA-TAMRA-3’。

2.用權利要求1所述的引物及探針制備的鑒別檢測裂谷熱病毒的雙重熒光定量RT-PCR試劑盒。

3.權利要求1所述的引物及探針在鑒別檢測裂谷熱病毒的雙重熒光定量RT-PCR中的應用，該應用僅限于診斷疾病以外的應用，其特征在于，

(1)合成權利要求1所述的引物及探針；

(2)質粒標準品的制備：將包含登錄號為HE687307.1的裂谷熱病毒S片段和登錄號為HE687305的L片段進行基因合成，并克隆至載體pMD19-T中制成陽性質粒，即為標準品，將標準品10倍梯度稀釋至:1×10⁸-1×10¹拷貝/μl，儲存于-20℃備用；

(3)待測模板的制備：將包含登錄號為HE687307.1的裂谷熱病毒S片段和登錄號為HE687305的L片段進行基因合成，并克隆至表達載體pcDNA3.1中，轉染至293T細胞，收獲細胞裂解液用于制備陽性模板；

取100μl血清或細胞裂解液，或取100mg組織樣品，加入500μl PBS緩沖液進行充分研磨，-20℃反復凍融3次，12000rpm離心10分鐘，取上清液100μl，加入400μl TRIzol試劑，劇烈振蕩30秒，室溫孵育5-10分鐘，12000rpm離心5分鐘，棄沉淀，加入100μl氯仿，劇烈振蕩30秒，室溫孵育5-10分鐘，4℃，12000rpm離心15分鐘，吸取上層水相至另一新離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻10次，室溫孵育30分鐘，4℃，12000rpm離心15分鐘，棄上清，RNA沉淀于管底，加入500μl DEPC處理的水配置的75％乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀，4℃，12000rpm離心5分鐘，盡量棄上清，室溫晾干或真空干燥5-10分鐘，用20μl無RNase水溶解，即為檢測用RNA模板；

(4)進行雙重熒光定量RT-PCR反應：裂谷熱病毒雙重熒光定量RT-PCR方法的檢測結果判定：經檢測，若待檢樣品中含有裂谷熱病毒核苷酸則顯示FAM和JOE陽性擴增曲線；若待檢樣品中含有裂谷熱NSs缺失株核苷酸則顯示JOE陽性擴增曲線，FAM無擴增信號；若待檢樣品中不含有裂谷熱病毒核苷酸則均無擴增信號。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述雙重熒光定量RT-PCR檢測體系具體包括：

5.根據權利要求3或4所述的應用，其特征在于，所述雙重熒光定量RT-PCR反應的反應條件為：42℃5min；95℃10s；95℃5s、60℃34s，40個循環。