[發明專利]海參精子超低溫冷凍保存方法

有效

• 申請號: 201910653260.1
• 申請日: 2019-07-19
• 公開（公告）號: CN110326610B
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發明（設計）人: 常亞青;湛垚垚;趙譚軍;宋堅;張偉杰
• 申請（專利權）人: 大連海洋大學
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 大連非凡專利事務所 21220
• 代理人: 閃紅霞

本發明公開一種海參精子超低溫冷凍保存方法，依次按照如下步驟進行：取處于繁殖期的海參并擦干參體海水，由腹部解剖后挑出完整性腺，將完整性腺表面體液吸干后移至無菌培養皿中剪碎，吸取精液用300目的篩絹過濾；取過濾后的精液與冷凍保存液按照體積比為1：1～2注入冷凍管中混合均勻，冷凍保存液是在每升蒸餾水中加入8～15g葡萄糖、7～9g氯化鈉、0.5～0.7g氯化鉀、3～5g海藻糖、0.05～0.1g無水氯化鈣和80～120 mL純度≥99.7%的二甲基亞砜；將冷凍管懸置在距離液氮表面10～15cm處10min，然后再將冷凍管懸置在液氮表面處5min，最后將冷凍管浸入液氮中冷凍保存。

技術領域

本發明屬于海參低溫生物學及種質超低溫冷凍保存技術領域，尤其涉及一種海參精子超低溫冷凍保存方法。

背景技術

海參屬于棘皮動物門(Echinodermata)，游走亞門(Eleutherozea)，海參綱（Holothuroidea），廣泛分布于全球溫帶區及熱帶區海洋，是最常見的海洋高等無脊椎動物。海參“其性溫補，足敵人參”富含多種營養元素和生物活性物質，是藥食同源的滋補佳品。隨著海參市場需求以及產業規模逐年擴大，野生海參的過度采捕日趨嚴重，使得野生海參的資源量和種質質量急劇下降，養殖海參亦出現單產降低和種質退化等問題。為此，目前研究人員多采用地理隔離較大的南北海參雜交方法以提高海參種質質量。但是，由于南北雌雄海參并不同步成熟，以至于在海參雜交過程中均需采用催熟、促排等手段，不僅操作復雜、成本高，而且還會出現因催熟、促排失敗而導致雜交無法實現等問題。

2006年，Shao等人發表的論文（Shao M Y , Zhang Z F , Yu L , et al.Cryopreservation of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) sperm [J].Aquaculture Research, 2006, 37(14):1450-1457.）中使用保存液對海參精子稀釋后進行冷凍保存。該方法操作時間達1小時，精子活力損失較大；保存液配方為423.00 mM NaCl、9.00 mM KCl、 9.27 mM CaCl₂、22.94 mM MgCl₂、22.50 mM MgSO₄ 和10 mM Hepes緩沖液＋15% 二甲基亞砜。Hepes緩沖液不僅價格較高且暴露于可見光下會產生具一定生物毒性的過氧化氫；精子保存時間短（1小時），解凍后，精子壽命僅為1200s，難以應用于生產。

發明內容

本發明是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種海參精子超低溫冷凍保存方法。

本發明的技術解決方案是：一種海參精子超低溫冷凍保存方法，其特征在于依次按照如下步驟進行：

a. 取處于繁殖期的海參并擦干參體海水，由腹部解剖后挑出完整性腺，將完整性腺表面體液吸干后移至無菌培養皿中剪碎，吸取精液用300目的篩絹過濾；

b. 取過濾后的精液與冷凍保存液按照體積比為1：1～2注入冷凍管中混合均勻，所述冷凍保存液是在每升蒸餾水中加入8～15g葡萄糖、7～9g氯化鈉、0.5～0.7g氯化鉀、3～5g海藻糖、0.05～0.1g無水氯化鈣和80～120 mL純度≥99.7%的二甲基亞砜；

c. 將冷凍管懸置在距離液氮表面10～15cm處10min，然后再將冷凍管懸置在液氮表面處5min，最后將冷凍管浸入液氮中冷凍保存。

本發明操作時間短（15~20 min），避免精子活力損失較大的問題；所用保存液成本低且無毒；保存時間長（對精子冷凍保存17天），精子最高成活率達到19.00±4.00%，壽命達2817.33s；解凍復蘇的精子的受精率可達83.72～83.74%，卵裂率（統計2～4細胞期以上）達到77.67～87.05%，受精20小時后，測定囊胚孵化率為56.47～65.00%，適用于海參人工繁殖、雜交育種以及種質資源保存等方面。