[發(fā)明專利]一類腺依賴病毒病毒重組質(zhì)粒、重組病毒及構(gòu)建方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910647327.0
• 申請(qǐng)日: 2019-07-17
• 公開（公告）號(hào): CN110295151A
• 公開（公告）日: 2019-10-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏玉龍;劉玉竹;郝國(guó)靜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 博鑫儀器（天津）有限公司
• 主分類號(hào): C12N7/01
• 分類號(hào): C12N7/01;C12N15/864
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11616
• 代理人: 梁永昌

本發(fā)明涉及一類5型腺依賴病毒重組病毒及生產(chǎn)方法，屬于病毒改造及構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的5型腺依賴病毒重組病毒為：針對(duì)5型腺依賴病毒與腺依賴病毒受體(Adeno?Associated Virus receptor，AAVR)的作用靶點(diǎn)區(qū)域氨基酸突變的5型腺依賴病毒(Adeno?Associated Virus 5，AAV5)。本發(fā)明提供的腺依賴病毒重組病毒具有高純度和高效價(jià)。(附圖1)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及病毒生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一類腺依賴病毒重組病毒的重組方法。

背景技術(shù)

1型血清型腺依賴病毒(Adeno-Associated Virus serotype 5，AAV5)，屬于細(xì)小病毒家族屬中的一員。由于其可以廣泛地感染人的不同組織、具有低免疫原性、天然條件下不致病等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸成為國(guó)際上用于基因治療的優(yōu)選病毒載體。已有文獻(xiàn)報(bào)道通過全基因組功能損失的篩選，發(fā)現(xiàn)腺依賴病毒受體(Adeno-Associated Virus Receptor,AAVR)蛋白，是包含1型腺依賴病毒在內(nèi)的多種血清型的腺依賴病毒入侵宿主細(xì)胞的必要受體。AAV5與AAVR的相互作用直接且特殊，這種相互作用需要AAV5結(jié)合到靶細(xì)胞上，AAV5的衣殼蛋白直接識(shí)別細(xì)胞表面的AAVR受體蛋白，AAV5的衣殼蛋白與AAVR受體蛋白的親和度將影響病毒的感染效率。

在腺依賴病毒的基因治療臨床使用中，病毒的感染效率不足增加了病毒的使用劑量，從而既增加了成本，又增強(qiáng)了病毒過量帶來(lái)的致死風(fēng)險(xiǎn)。

因此，發(fā)現(xiàn)從何種角度去增強(qiáng)病毒的感染效率變得十分緊迫。本發(fā)明立足于結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段，發(fā)現(xiàn)了AAV5與受體蛋白AAVR的相互作用位點(diǎn)，以及能夠提高病毒感染效率的突變位點(diǎn)，從而為重組病毒的設(shè)計(jì)提供了依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一類腺依賴病毒病毒重組質(zhì)粒、重組病毒及構(gòu)建方法。本發(fā)明提供的1型腺依賴病毒重組病毒具有高病毒滴度和病毒增殖能力。

優(yōu)選的是腺依賴病毒病毒衣殼VP1蛋白的第531位絲氨酸由Ser突變?yōu)锳la(S531A)。

本發(fā)明提供了一種腺依賴病毒重組病毒，所述腺依賴病毒重組病毒為：針對(duì)AAV5與AAVR的作用靶點(diǎn)區(qū)域氨基酸突變的腺依賴病毒。

本發(fā)明還提供了一類腺依賴病毒病毒重組質(zhì)粒，所述腺依賴病毒重組質(zhì)粒為負(fù)載上述技術(shù)方案所述腺依賴病毒重組病毒全長(zhǎng)核苷酸序列的質(zhì)粒。

優(yōu)選的是，用于負(fù)載上述技術(shù)方案所述能夠表達(dá)腺依賴病毒全長(zhǎng)氨基酸序列的質(zhì)粒包括pRC-AV5。

優(yōu)選的是，所述能夠表達(dá)腺依賴病毒全長(zhǎng)氨基酸序列的未經(jīng)突變的質(zhì)粒，核苷酸全序列如SEQ ID NO.1,表達(dá)出的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述重組質(zhì)粒pRC-S531A的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

1)設(shè)計(jì)突變引物；

2)構(gòu)建突變質(zhì)粒pRC-S531A，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、DMT酶切消化后，進(jìn)行轉(zhuǎn)化和提取鑒定以完成定點(diǎn)突變，得到含5型腺依賴病毒突變基因的重組質(zhì)粒；

優(yōu)選的是，步驟2)所述定點(diǎn)突變采用全式金公司快速定點(diǎn)突變?cè)噭┖羞M(jìn)行。

本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述腺依賴病毒重組病毒的包裝方法，包括以下步驟：

將上述方法所構(gòu)建的突變重組質(zhì)粒，連同輔助質(zhì)粒和基因組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，裂解細(xì)胞并純化得到1型腺依賴病毒突變重組病毒。

優(yōu)選的是，所述細(xì)胞包括但不限定于293T細(xì)胞。

優(yōu)選的是，所述輔助質(zhì)粒包括但不限定于pHelper。

優(yōu)選的是，所述基因組質(zhì)粒包括但不限定于pGFP。