[發明專利]一種用于顯微注射的松材線蟲蟲體固定方法

有效

• 申請號: 201910637583.1
• 申請日: 2019-07-15
• 公開（公告）號: CN110338153B
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發明（設計）人: 白麗群;朱娜婕;胡加付
• 申請（專利權）人: 杭州森康林業科技有限公司
• 主分類號: A01K67/033
• 分類號: A01K67/033;C12N15/89
• 代理公司: 北京哌智科創知識產權代理事務所(普通合伙) 11745
• 代理人: 何浩

1.一種用于顯微注射的松材線蟲蟲體固定方法，其特征在于，采用瓊脂糖水溶液制備固定墊，然后用固定墊固定松材線蟲蟲體；

具體步驟如下：

1)蟲體選擇與清洗：挑選健康活躍的松材線蟲成蟲，濾除線蟲懸液中的菌絲雜質，再用無菌水清洗松材線蟲2-3遍，濃縮于1.5ml離心管中備用；

2)角質層軟化：用SDS-DTT溶液室溫黑暗條件下處理松材線蟲1h，再用無菌水清洗2-3遍；

3)角質層消解：用pronase E溶液室溫處理松材線蟲5h，用無菌水清洗2-3遍，放置于無菌水中備用；

4)固定墊制備：配制濃度為1.5％-5.0％的瓊脂糖水溶液，用微波爐加熱2min，用移液槍吸取50μl液滴快速滴于蓋玻片上，迅速用另一蓋玻片蓋在液滴上，待瓊脂糖凝固穩定后，將兩個蓋玻片分開，讓瓊脂糖墊完整地黏附于其中一個蓋玻片，將黏有瓊脂糖固定墊的蓋玻片置于65℃干燥箱中干燥處理1h，4℃冰箱保存備用；

5)蟲體固定：用睫毛針自水中挑取一條松材線蟲成蟲，快速放置于制備好的固定墊上，在解剖鏡下用睫毛針輕輕下壓蟲體全身，使蟲體表面水膜被固定墊吸收，迅速在蟲體全身覆蓋上注射油，完成固定。

2.如權利要求1所述的一種用于顯微注射的松材線蟲蟲體固定方法，其特征為，步驟2)中SDS-DTT溶液的原液配方由以下組分組成：200mM DTT、2.5％SDS、20mM HEPES、3％蔗糖，該原液PH為8.0，原液配置完成后需經過0.22μm無菌過濾器過濾處理，再分裝保存于-20℃冰箱；SDS-DTT溶液的工作濃度為原液的10％。

3.如權利要求1所述的一種用于顯微注射的松材線蟲蟲體固定方法，其特征在于，步驟3)中pronase E溶液的原液濃度為15mg/ml，原液配置完成后需經過0.22μm無菌過濾器過濾處理，再分裝保存于-20℃冰箱；步驟3)中使用的pronase E溶液工作濃度為原液的10％。

4.如權利要求1所述的一種用于顯微注射的松材線蟲蟲體固定方法，其特征在于，步驟4)中瓊脂糖水溶液的濃度為2％-4％。

5.如權利要求4所述的一種用于顯微注射的松材線蟲蟲體固定方法，其特征在于，所述瓊脂糖水溶液的最佳濃度為3％。

6.如權利要求1所述的一種用于顯微注射的松材線蟲蟲體固定方法，其特征在于，步驟4)中蓋玻片長度、寬度和厚度分別為50mm、24mm和0.15mm。

7.如權利要求1所述的一種用于顯微注射的松材線蟲蟲體固定方法，其特征在于，步驟4)固定墊制備過程中不能產生氣泡，以免降低對蟲體的固定效果。

8.如權利要求1所述的一種用于顯微注射的松材線蟲蟲體固定方法，其特征在于，步驟5)中睫毛針包括針頭(1)和針桿(2)，針頭的一端與針桿的一端用針座(3)連結和固定，針頭采用假睫毛材料制成，針頭遠離針桿的一端呈弧形設置。

9.如權利要求1所述的一種用于顯微注射的松材線蟲蟲體固定方法，其特征在于，步驟5)中從水中挑取的松材線蟲成蟲不宜在空中停留時間過長，蟲體體表需保留有均勻的水膜，以便為固定墊提供適量水份，更加有效地固定蟲體。