[發(fā)明專利]一種降解蛋白質(zhì)的產(chǎn)朊假絲酵母單基因表達(dá)菌株及其構(gòu)建方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201910633365.0
• 申請日: 2019-07-12
• 公開（公告）號(hào): CN110305806A
• 公開（公告）日: 2019-10-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉澤寰;林蔣海;孫濤
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東利世康低碳科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N15/57;C12N15/81;C12R1/72
• 代理公司: 廣州潤禾知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44446
• 代理人: 鄭永泉

1.一種降解蛋白質(zhì)的產(chǎn)朊假絲酵母單基因表達(dá)菌株，其特征在于，所述產(chǎn)朊假絲酵母單基因表達(dá)菌株為將羧肽酶基因通過產(chǎn)朊假絲酵母表達(dá)載體整合至產(chǎn)朊假絲酵母基因組上構(gòu)建而成。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種降解蛋白質(zhì)的產(chǎn)朊假絲酵母單基因表達(dá)載體，其特征在于，所述的產(chǎn)朊假絲酵母表達(dá)載體為產(chǎn)朊假絲酵母單基因表達(dá)載體。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種降解蛋白質(zhì)的產(chǎn)朊假絲酵母單基因表達(dá)菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述產(chǎn)朊假絲酵母表達(dá)載體為pcGAPGA。

4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的一種降解蛋白質(zhì)的產(chǎn)朊假絲酵母單基因表達(dá)菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：克隆黑曲霉中的羧肽酶基因；

S2：將上述羧肽酶基因接入產(chǎn)朊假絲酵母表達(dá)載體中，構(gòu)建重組單基因表達(dá)載體；

S3：將上述構(gòu)建得到的重組單基因表達(dá)載體用限制性核酸內(nèi)切酶切割，使之線性化后轉(zhuǎn)化產(chǎn)朊假絲酵母，構(gòu)建基因重組產(chǎn)朊假絲酵母單基因表達(dá)菌株。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種降解蛋白質(zhì)的產(chǎn)朊假絲酵母單基因表達(dá)菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟S2中包括如下步驟：

S21：將克隆得到的羧肽酶基因進(jìn)行純化得到pMD19T-pepF克隆載體；

S22：將克隆載體pMD19T-pepF和表達(dá)載體pcGAPGA進(jìn)行雙酶切；

S23：將回收到的羧肽酶目的基因片段與酶切后的pcGAPGA骨架進(jìn)行連接形成新的質(zhì)粒pcGAPGA-pepF。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種降解蛋白質(zhì)的產(chǎn)朊假絲酵母單基因表達(dá)菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟S3中的限制性核酸內(nèi)切酶為ScaI。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種降解蛋白質(zhì)的產(chǎn)朊假絲酵母單基因表達(dá)菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S3中所述的轉(zhuǎn)化是使用電轉(zhuǎn)化法、冷凍法或化學(xué)試劑法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種降解蛋白質(zhì)的產(chǎn)朊假絲酵母單基因表達(dá)菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟S22中，將克隆載體pMD19T-pepF與表達(dá)載體pGAPGA同時(shí)用XhoI和XbaI兩種內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切。

9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種降解蛋白質(zhì)的產(chǎn)朊假絲酵母單基因表達(dá)菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟S1中的羧肽酶基因?yàn)楹谇沟聂入拿富騪epF。

10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種降解蛋白質(zhì)的產(chǎn)朊假絲酵母單基因表達(dá)菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述產(chǎn)朊假絲酵母表達(dá)載體為含有CuGAP啟動(dòng)子或ScTEF1啟動(dòng)子的產(chǎn)朊假絲酵母表達(dá)載體pGAPGA。