[發(fā)明專利]基于石榴全基因組序列開發(fā)的SSR核心引物組及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910631857.6
• 申請日: 2019-07-12
• 公開（公告）號: CN110205404B
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 秦改花;徐義流;劉春燕;齊永杰;高正輝;伊興凱;潘海發(fā);張曉玲;黎積譽(yù)
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 杭州奧創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33272
• 代理人: 趙梅

本發(fā)明公開了基于石榴全基因組序列開發(fā)的SSR核心引物組及其應(yīng)用，該引物組包括11對引物：PG080、PG130、PG139、PG152、PG153、PG140、PG098、PG070、PG077、PG090、PG093，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1?22所示。本發(fā)明的SSR核心引物組具有多態(tài)性高，重復(fù)性好、標(biāo)記穩(wěn)定、帶型清晰易判讀等優(yōu)點(diǎn)，可用于石榴品種鑒定、DNA指紋圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性評價與系統(tǒng)發(fā)育研究等領(lǐng)域，為石榴分子標(biāo)記輔助選擇提供了新的工具，具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是利用石榴全基因組序列開發(fā)SSR核心引物組及在石榴品種鑒定、指紋圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性評價與系統(tǒng)發(fā)育研究中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

微衛(wèi)星(Simple Sequence Repeats，SSR)標(biāo)記，是指以1～6個核苷酸為單位，廣泛存在于基因組中的簡單重復(fù)序列。SSR具有分布廣、共顯性遺傳、多態(tài)性高、檢測方便且穩(wěn)定的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于品種鑒定、遺傳多樣性評價以及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究、遺傳圖譜構(gòu)建及QTLs定位等諸多研究領(lǐng)域。前期，SSR標(biāo)記的開發(fā)主要基于基因組DNA文庫或者富含特異微衛(wèi)星的文庫，該方法工作量大且得到的標(biāo)記數(shù)量比較有限；近年來，隨著全基因組測序工作的完成，基于全基因組序列開發(fā)SSR標(biāo)記，可獲得的標(biāo)記數(shù)量豐富，覆蓋整個基因組，且在基因組上分布均勻，被廣泛應(yīng)用于多種已測序植物中。

石榴是最早被人類認(rèn)識可以食用的果樹，原產(chǎn)于波斯地區(qū)(今伊朗)一帶，公元前5世紀(jì)開始被人類馴化。據(jù)記載，石榴在張騫出使西域時傳入我國，在我國已有2000多年的栽培的歷史。石榴遺傳資源豐富，據(jù)《中國果樹志(石榴卷)》記載，我國現(xiàn)有石榴資源300多份，根據(jù)風(fēng)味可分為甜石榴和酸石榴，根據(jù)籽粒硬度可分為硬籽石榴和軟籽石榴，根據(jù)其利用部位可分為觀賞石榴和食用石榴，根據(jù)顏色分可為紅皮、白皮、黃皮以及粉皮石榴等。由于石榴獨(dú)特的營養(yǎng)、保健、觀賞以及顯著的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益，石榴的栽培范圍逐漸擴(kuò)大，地方間引種頻繁；但由此也帶來了石榴品種間混雜嚴(yán)重，給石榴生產(chǎn)者和育種者帶來了新的挑戰(zhàn)。

基于石榴栽培歷史悠久、資源豐富、品種交流頻繁的現(xiàn)狀，開展石榴品種鑒定、指紋圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性評價及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究均有重要的現(xiàn)實(shí)意義，然而該工作的有效開展有賴于多態(tài)性高、重復(fù)性好、標(biāo)記穩(wěn)定的分子標(biāo)記開發(fā)。基于此，根據(jù)已有的石榴基因組序列，在全基因組上開發(fā)SSR標(biāo)記核心引物具有重要的價值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是在于提供利用全基因組數(shù)據(jù)快速開發(fā)SSR標(biāo)記，挑選引物組，這些引物具有擴(kuò)增穩(wěn)定、電泳條帶清晰、多態(tài)性豐富的優(yōu)點(diǎn)，可有效用于石榴品種鑒定、DNA指紋圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性評價與系統(tǒng)發(fā)育研究等領(lǐng)域。

本發(fā)明第一方面提供了一種基于石榴全基因組序列開發(fā)的SSR核心引物組，該引物組包括11對引物：PG080、PG130、PG139、PG152、PG153、PG140、PG098、PG070、PG077、PG090、PG093，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-22所示。

本發(fā)明第二方面提供了上述基于石榴全基因組序列開發(fā)的SSR核心引物組的開發(fā)方法，包括如下步驟：

(1)石榴基因組DNA提取：采用CTAB法提取DNA，加入50μL0.1M的TE緩沖液，溶解過夜，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

(2)石榴全基因組數(shù)據(jù)從DDBJ/ENA/GenBank數(shù)據(jù)庫下載，序列號MTKT00000000；利用MISA軟件在全基因組范圍內(nèi)挖掘不同重復(fù)單元SSR位點(diǎn)，SSR查找的標(biāo)準(zhǔn)為二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸的重復(fù)次數(shù)分別為11、8、6、5、4；

(3)SSR引物設(shè)計(jì)