[發(fā)明專利]同時檢測血液中維生素K1和維生素K2(MK4)方法

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• 申請日: 2019-07-12
• 公開（公告）號: CN110208437A
• 公開（公告）日: 2019-09-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 許麗;雒琴;賈永娟;倪君君
• 申請（專利權(quán)）人: 北京和合醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)股份有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/72;G01N30/04;G01N30/06;G01N30/86;G01N30/88
• 代理公司: 濟(jì)南信達(dá)專利事務(wù)所有限公司 37100
• 代理人: 李世喆

1.同時檢測血液中維生素K1和維生素K2(MK4)的方法，其特征在于，包括：

利用高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀，分別檢測至少三種濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中，所述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液為具有內(nèi)標(biāo)物的維生素K1和維生素K2(MK4)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，且所述至少三種濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中內(nèi)標(biāo)物濃度一致；

根據(jù)所述至少三種濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測結(jié)果，分別擬合維生素K1的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程以及維生素K2(MK4)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程；

向固定量的具有已知濃度內(nèi)標(biāo)物的混合內(nèi)標(biāo)溶液中，順序添加待檢測樣品離心后的第一上清液和沉淀蛋白試劑，混合，并添加萃取劑，混合，高速離心，取第二上清液，其中，所述第一上清液的添加量為50～300μL；

通過氮吹方式，吹干所述第二上清液，通過復(fù)溶液溶解吹干后的剩余物，混合，高速離心，取第三上清液；

利用高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀，檢測所述第三上清液；

基于所述第三上清液的檢測結(jié)果和維生素K1的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程以及維生素K2(MK4)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得到所述待檢測樣品中維生素K1和維生素K2(MK4)的濃度。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時檢測血液中維生素K1和維生素K2(MK4)的方法，其特征在于，

所述高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀中，

高效液相色譜的色譜條件包括：

長度為50mm、內(nèi)徑為3.0mm以及填料粒徑為2.7μm的C18色譜柱；

洗脫流動相為含0.05％-0.25％甲酸的甲醇以及含0.05％-0.25％甲酸的乙腈；

分析時長為4.0min；

柱溫為25-35℃；

進(jìn)樣量為0.1-30μL；

流速為0.50-1.00mL/min。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的同時檢測血液中維生素K1和維生素K2(MK4)的方法，其特征在于，

所述高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀中，

串聯(lián)質(zhì)譜條件包括：

采用大氣壓化學(xué)電離源APCI，正離子掃描模式，選擇反應(yīng)監(jiān)測模式，氣簾氣壓力為20psi；碰撞氣為5L/min；溫度為300℃；霧化氣壓力為25psi；放電電流為1mA。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時檢測血液中維生素K1和維生素K2(MK4)的方法，其特征在于，

所述具有已知濃度內(nèi)標(biāo)物的混合內(nèi)標(biāo)溶液的固定量為10μL；

和/或，

所述沉淀蛋白試劑為乙醇，所述乙醇的用量為100～500μL；

和/或，

所述萃取試劑為正己烷，所述正己烷的用量為800～1200μL；

和/或，

所述復(fù)溶液為乙腈，所述乙腈的用量為50～200μL。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的同時檢測血液中維生素K1和維生素K2(MK4)的方法，其特征在于，

所述高效液相色譜采用梯度洗脫。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的同時檢測血液中維生素K1和維生素K2(MK4)的方法，其特征在于，

所述梯度洗脫，包括：

0.0～1.5min，含0.05％-0.25％甲酸的甲醇與含0.05％-0.25％甲酸的乙腈的體積比為25：75；1.5～3.4min，含0.05％-0.25％甲酸的甲醇與含0.05％-0.25％甲酸的乙腈的體積比為100：0；3.4～3.5min，含0.05％-0.25％甲酸的甲醇與含0.05％-0.25％甲酸的乙腈的體積比為25：75。

7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一所述的同時檢測血液中維生素K1和維生素K2(MK4)的方法，其特征在于，

所述維生素K1的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中的兩個變量分別為：

維生素K1的色譜峰面積與對應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積的比值以及維生素K1濃度與對應(yīng)內(nèi)標(biāo)物濃度的比值；

所述維生素K2(MK4)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中的兩個變量分別為：

維生素K2(MK4)的色譜峰面積與對應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積的比值以及維生素K2(MK4)濃度與對應(yīng)內(nèi)標(biāo)物濃度的比值。