[發明專利]一種高效精準靶向的基因整合系統及其應用

有效

• 申請號: 201910628110.5
• 申請日: 2019-07-12
• 公開（公告）號: CN110305908B
• 公開（公告）日: 2021-08-20
• 發明（設計）人: 榮知立;林瑛;馬淑鳳;王新龍;呂杰;劉成芳
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/85
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務所 11430
• 代理人: 范盈

1.一種高效精準靶向的基因整合系統，其特征在于，包括表達外源性融合蛋白系統、一種向導RNA和供體載體；

所述表達外源性融合蛋白系統包括Cas9與SB、N123、N57、SB100XE279D其中之一組成的融合蛋白；

所述向導RNA為靶向基因組區域和供體載體兩端的20bp的長序列；

所述供體載體兩端分別均有向導RNA靶向位點、SB結合位點和中間的目的基因整合片段；

所述基因組區域位于AAVS1、ACTB、GAPDH、PGK1和Rosa26。

2.根據權利要求1所述的高效精準靶向的基因整合系統，其特征在于，所述表達外源性融合蛋白系統還包括CAG啟動子和polyA。

3.根據權利要求1所述的高效精準靶向的基因整合系統，其特征在于，所述向導RNA包括U6啟動子、gRNA識別序列、gRNA骨架序列、U6啟動子的終止序列。

4.根據權利要求1所述的高效精準靶向的基因整合系統，其特征在于，所述供體載體包括以下四個部分：

第一部分，敲入基因表達元件，包括啟動子、目的基因表達序列和polyA；

第二部分，體內線性化元件，包括位于整個供體載體兩端方向相同的20bp的gRNA識別序列識別位點和3bp的向導RNA識別的PAM序列，即NGG；

第三部分，SB結合元件，包括位于鄰位的體內線性化元件內部的2個IRs，其中每一個IR中均包含兩個15-20bp長度的SB的結合序列，其與SB轉座酶的N端結合并形成四聚體；

第四部分，抗性篩選元件，包括T2A、puromycin抗性基因表達序列和bGH polyA。

5.根據權利要求4所述的高效精準靶向的基因整合系統，其特征在于，所述供體載體的元件在同一個載體上，順序依次為：20bp的gRNA識別序列識別位點、3bp PAM區、IR、T2A、puromycin抗性基因表達序列、bGH polyA、SV40polyA、目的基因表達序列、啟動子、IR和20bp的gRNA識別序列識別位點、3bp PAM區。

6.根據權利要求1所述的高效精準靶向的基因整合系統，其特征在于，通過CRISPR-CAS9切割基因組靶向位點和供體載體兩端向導RNA識別位點，以同時實現靶向位點基因的開放和供體載體體內線性化；通過SB、N123、N57或SB100XE279D將所述的體內線性化的供體載體引導到所述的開放的靶向基因位點，并利用非同源末端直接連接把所述供體載體敲入基因組靶位點；其中所述通過CRISPR-CAS9切割基因組位點和供體載體兩端向導RNA識別位點中，所述基因組區域位于AAVS1、ACTB、GAPDH、PGK1和Rosa26。

7.根據權利要求6所述的高效精準靶向的基因整合系統，其特征在于，體內線性化的外源基因無需同源臂可直接實現靶向基因組靶位點整合。