[發明專利]一種O24型鴨致病性大腸桿菌菌蛻的制備方法

在審

• 申請號: 201910623938.1
• 申請日: 2019-07-11
• 公開（公告）號: CN110408581A
• 公開（公告）日: 2019-11-05
• 發明（設計）人: 袁橙;郭長明;張步彩;郝福星;蔡丙嚴;唐炳紅;劉劍華;唐晨晨
• 申請（專利權）人: 江蘇農牧科技職業學院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 北京思創大成知識產權代理有限公司 11614
• 代理人: 尹慧晶

1.一種O24型鴨致病性大腸桿菌菌蛻的制備方法，其特征在于，該方法包括分離菌株、血清型鑒定、溶菌質粒的構建、菌蛻的制備及滅活處理步驟；其中，在溶菌質粒的構建時使用pBV221載體對血清型為O24的大腸桿菌菌株進行溶菌質粒的構建；滅活處理時采用β-丙內酯。

2.根據權利要求1所述的O24型鴨致病性大腸桿菌菌蛻的制備方法，其特征在于，所述的用pBV221載體對血清型為O24的大腸桿菌菌株進行溶菌質粒的構建的方法為：將E基因連接至pUC57載體，得到pUC57-E；再用限制性內切酶EcoR I和Sal I雙酶切重組質粒pUC57-E和表達載體pBV221，利用T4 DNA連接酶將E基因片段連接至載體pBV221，連接產物轉化至DH5α感受態細胞，在氨芐抗性平板上篩選陽性克隆并擴大培養，從菌液中提取質粒并進行雙酶切鑒定和測序鑒定，構建pBV221-E溶菌質粒。

3.根據權利要求1所述的O24型鴨致病性大腸桿菌菌蛻的制備方法，其特征在于，所述的菌蛻的制備方法為：將構建的pBV221-E溶菌質粒轉化至上述分離菌株，用氨芐抗性平板篩選陽性克隆，通過篩選鑒定得到pBV221-E/D陽性克隆，將pBV221-E/D菌液在28℃-35℃振蕩培養至OD₆₀₀為0.5，將OD₆₀₀為0.5的菌液置于40℃-42℃誘導表達，每隔30min取樣測量菌液的OD₆₀₀值；誘導表達培養至pBV221-E/D菌液的OD₆₀₀值不變時，即為菌蛻的菌液。

4.根據權利要求1所述的O24型鴨致病性大腸桿菌菌蛻的制備方法，其特征在于，采用β-丙內酯兩次對制備的菌蛻進行滅活處理。

5.根據權利要求4所述的O24型鴨致病性大腸桿菌菌蛻的制備方法，其特征在于，所述的滅活處理步驟為：將制備得到的菌蛻的菌液中加入β-丙內酯至終濃度為0.025％，靜置作用后，離心，收集沉淀；先在沉淀中加與原始菌液等體積的PBS溶液重懸，離心并收集沉淀；再在前述沉淀中加原始菌液1/2體積的PBS溶液重懸，離心并收集沉淀；最后再在前述沉淀中加原始菌液1/5體積的PBS溶液重懸，然后加入β-丙內酯至終濃度為0.05％，再次靜置作用，得到O24型鴨致病性大腸桿菌菌蛻。

6.根據權利要求5所述的O24型鴨致病性大腸桿菌菌蛻的制備方法，其特征在于，所述的第一次靜置作用的反應條件為37～42℃下作用1～2h，再次靜置作用的反應條件為37～42℃作用2～3h。

7.根據權利要求1所述的O24型鴨致病性大腸桿菌菌蛻的制備方法，其特征在于，所述的血清型鑒定是通過玻板凝集試驗和/或試管凝集試驗對鴨致病性大腸桿菌進行血清型鑒定，分離鑒定出血清型為O24的大腸桿菌菌株。

8.根據權利要求7所述的O24型鴨致病性大腸桿菌菌蛻的制備方法，其特征在于，所述的血清型鑒定的具體步驟為：將鴨致病性大腸桿菌菌株接種于2mL LB液體培養基，先在37℃下150～200rpm震蕩培養10-20h，再在121℃、103.4kPa高壓下培養2h，然后高壓后的菌液離心棄上清液，用400μL 0.5％的石炭酸生理鹽水重懸菌體并制成濃稠懸液，作為大腸桿菌菌體抗原；取7μL大腸桿菌菌體抗原與2μL大腸桿菌O抗原血清置于玻板上混勻至出現凝集，確定血清型。

9.根據權利要求1所述的O24型鴨致病性大腸桿菌菌蛻的制備方法，其特征在于，所述的分離菌株包括麥康凱培養基篩選、生化鑒定和PCR檢測步驟。

10.根據權利要求1所述的O24型鴨致病性大腸桿菌菌蛻的制備方法，其特征在于，所述的pBV221載體是氨芐青霉素抗性的pBV221載體。