[發(fā)明專利]用于甘薯葉形調(diào)控的miRNA及編碼核酸分子與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910620077.1
• 申請日: 2019-07-10
• 公開（公告）號: CN110331143B
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王愛民;任磊;張婷婷;馬代夫
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇師范大學(xué)
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/82;C12N1/21;A01H5/00;A01H6/00
• 代理公司: 徐州市三聯(lián)專利事務(wù)所 32220
• 代理人: 陳鵬

本發(fā)明公開了一種用于甘薯葉形調(diào)控的miRNA，屬于植物遺傳技術(shù)領(lǐng)域，其具有SEQ ID NO.1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了Ib?miR319a及其編碼基因，構(gòu)建了35S啟動子驅(qū)動靶基因模擬物低表達(dá)IbmiR319a的雙元載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)浸染甘薯胚性愈傷組織，經(jīng)過篩選、分化得到轉(zhuǎn)基因陽性植株，通過對轉(zhuǎn)基因植株葉片的表型進(jìn)行鑒定，表明各轉(zhuǎn)基因株系中miR319a的表達(dá)量均顯著下調(diào)，且各轉(zhuǎn)基因株系葉片的寬度明顯減少，葉片長寬比明顯增加。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物遺傳技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于甘薯葉形調(diào)控的miRNA及編碼核酸分子與應(yīng)用。

背景技術(shù)

MicroRNA(miRNA) 是生物體內(nèi)普遍存在的一類內(nèi)源性的、大小為21-24個核苷酸(nucleotides，nt)的非編碼小RNA，通過與靶基因序列互補(bǔ)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平造成靶基因沉默，從而控制發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)和激素信號或動物和植物代謝。

在植物中，miRNA來源于核內(nèi)長的單鏈的RNA分子（ssRNA），通過內(nèi)部堿基互補(bǔ)配對形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的 miRNA 初級轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA），經(jīng)核酸內(nèi)切酶DCL1（Dicer-like RNaseIII protein I）切割產(chǎn)生前體miRNA（pre-miRNA），由Dicer酶切割前體miRNA的環(huán)釋放出成熟的雙鏈miRNA（miRNA/miRNA*），3’端經(jīng)HEN1（Hua enchancer1）甲基化后再經(jīng)轉(zhuǎn)運蛋白運送至胞質(zhì)。單鏈的miRNA*脫離雙鏈后，與Argonaute（AGO）和Dicer等組成沉默復(fù)合體（RNA-Induced Silencing Complex, RISC），在miRNA鏈的指導(dǎo)下作用于靶mRNA進(jìn)行剪切導(dǎo)致靶基因的沉默。miRNA 與其靶基因構(gòu)成的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)位于基因表達(dá)的上游核心位置，miRNA通過控制一系列轉(zhuǎn)錄因子、脅迫響應(yīng)蛋白及其他相關(guān)調(diào)控蛋白影響植物的整個生長發(fā)育過程、生理生化及多種逆境脅迫響應(yīng)。

理論研究結(jié)果表明，miRNA 具備為植物遺傳改良提供豐富基因資源的潛能，但目前對其在生產(chǎn)上應(yīng)用的研究相對滯后。甘薯 (Ipomoea batatas (L.) Lam.)，是世界上重要的糧食、蔬菜、飼料、工業(yè)原料和生物能源作物，是我國糧食安全的底線作物。近年來，甘薯的保健功能也日益引起人們的關(guān)注。葉片形態(tài)的改良是甘薯育種的重要目標(biāo)之一。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用于甘薯葉形調(diào)控的miRNA及編碼核酸分子與應(yīng)用。

一種用于甘薯葉形調(diào)控的miRNA，其序列為uuggacugaa gggagcuccc。

另外，本發(fā)明還提供了一種含有所述miRNA的表達(dá)載體pCAMBIA1301-35S-mimicsmiR319a。

另外，本發(fā)明還提供了一種含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌宿主細(xì)胞EHA105:pCAMBIA1301 -35S-mimics miR319a。

本發(fā)明還提供了一種農(nóng)桿菌宿主細(xì)胞LBA4404: pCAMBIA1301-35S-mimicsmiR319a的構(gòu)建方法。

最后，本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體在轉(zhuǎn)化植物獲得轉(zhuǎn)基因植株中的應(yīng)用。

作為改進(jìn)，所述植物為甘薯莖尖誘導(dǎo)的胚性愈傷組織，具體過程如下：

步驟一、將陽性克隆接種到含100μg/ml Kan的50ml YEB液體培養(yǎng)基中，28℃200rpm繼續(xù)培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.5-1.0，然后6000rpm 4℃離心10分鐘，棄培養(yǎng)液，收集菌體；

步驟二、用pH為5.3的50ml MS培養(yǎng)液清洗菌體后，6000rpm 4℃離心10分鐘，再用pH為5.3的20ml MS培養(yǎng)液附加200μM乙酰丁香酮懸浮菌體至OD₆₀₀＝1.0，制備成侵染液，與甘薯胚性愈傷組織懸浮細(xì)胞于22℃下共培養(yǎng)3天；