[發(fā)明專利]一種CHO細胞培養(yǎng)的補料培養(yǎng)基及其制備方法和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910617672.X
• 申請日: 2019-07-10
• 公開（公告）號: CN110343666B
• 公開（公告）日: 2023-05-30
• 發(fā)明（設計）人: 王德朋;王明焱;李美嬌;錢瑞鵬;冷春生;常曉慧
• 申請（專利權(quán)）人: 通化東寶藥業(yè)股份有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12P21/08;C12P21/00
• 代理公司: 北京瑞恒信達知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 11382
• 代理人: 李琰

1.一種CHO細胞培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

I）接種CHO細胞株至基礎(chǔ)培養(yǎng)基中；

II)?自接種后每天監(jiān)測活細胞密度、細胞活力和葡萄糖含量，如有必要，補充葡萄糖；

III）自接種第4天起每天補加補料培養(yǎng)基和市售補料培養(yǎng)基，所述的補料培養(yǎng)基和市售補料培養(yǎng)基的體積比為1:10；

所述補料培養(yǎng)基組成為氨基酸、維生素、氫氧化鈉和注射用水；其中，氨基酸組成為L-天冬氨酸、L-酪氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸；所述維生素組成為核黃素、葉酸、維生素B12、生物素、亞硫酸氫鈉甲萘醌、鹽酸硫胺素和L-抗壞血酸；

以所述補料培養(yǎng)基的總質(zhì)量為基準，各組分的質(zhì)量百分比為：

L-天冬氨酸2.5%-5.5%、L-酪氨酸1.5%-4.5%、L-蘇氨酸1.5%-3%、L-色氨酸1%-1.75%、L-谷氨酸2%-5%，核黃素0.0005%-0.004%、葉酸0.00125%-0.01%、維生素B12?0.00125%-0.01%、生物素0.002%-0.016%、亞硫酸氫鈉甲萘醌?0.0035%-0.028%，鹽酸硫胺素0.0025%-0.02%，L-抗壞血酸0.0075%-0.06%，氫氧化鈉2.5%-5.5%，余量為注射用水；

所述市售補料培養(yǎng)基選自Gibco生產(chǎn)的Gibco??CHO?CD?EfficientFeed??A+、Gibco??CHO?CD?EfficientFeed??B+和Gibco??CHO?CD?EfficientFeed??C+中的一種；

IV）收獲，分離純化得到目的蛋白。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CHO細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述CHO細胞培養(yǎng)方法包括搖瓶培養(yǎng)和大規(guī)模培養(yǎng)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CHO細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述CHO細胞株為包含目的蛋白核酸編碼的CHO-K1細胞。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CHO細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟III）中，以所述補料培養(yǎng)基的總質(zhì)量為基準，各組分的質(zhì)量百分比為：

L-天冬氨酸3.5%-4.5%、L-酪氨酸2.5%-3.5%、L-蘇氨酸2%-2.5%、L-色氨酸1.25%-1.5%、L-谷氨酸3%-4%，核黃素0.001%-0.002%、葉酸0.0025%-0.005%、維生素B12?0.0025%-0.005%、生物素0.004%-0.008%、亞硫酸氫鈉甲萘醌?0.007%-0.014%、鹽酸硫胺素0.005%-0.01%，L-抗壞血酸0.0015%-0.03%，氫氧化鈉3.5%-4.5%，余量為注射用水。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的CHO細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述補料培養(yǎng)基通過包括如下步驟的方法制備：

1）根據(jù)制備的所述補料培養(yǎng)基的總質(zhì)量，按權(quán)利要求1或4中所述比例稱取所述氨基酸、維生素和氫氧化鈉；

2）將氫氧化鈉加入注射水中溶解，定容至5mol/L，冷卻至室溫，得到氫氧化鈉溶液；

3）另取注射用水，加入步驟2）制備的氫氧化鈉溶液總量的90%，攪拌均勻；

4）將所述氨基酸、維生素加入步驟3）制備的溶液中，持續(xù)攪拌30~60min；

5）緩慢加入剩余的步驟2）制備的氫氧化鈉溶液，攪拌至粉末完全溶解；

6）用注射用水定容至配制總質(zhì)量；

7）攪拌5min以上，檢測pH值、濁度、滲透壓；

8）經(jīng)步驟7）檢測合格的溶液使用微孔濾膜過濾至無菌存儲裝置中，2-8℃下避光保存，即得。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的CHO細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟3）中，所述注射用水的量為所述補料培養(yǎng)基總質(zhì)量的79%-89%。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的CHO細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟3）中，所述注射用水的量為所述補料培養(yǎng)基總質(zhì)量的79%-83.21%。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的CHO細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟7）中，pH應大于11。