[發(fā)明專利]一種人源臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及凍存方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910612981.8
• 申請(qǐng)日: 2019-07-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110283783A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-09-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李哲浩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 賽瑞諾（北京）生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775;A01N1/02
• 代理公司: 北京細(xì)軟智谷知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11471
• 代理人: 張肖

1.一種人源臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)從臍帶組織中取華通氏膠部分組織，剪切得到組織塊；將所述組織塊置于培養(yǎng)皿中，于37℃，5％CO₂的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2～4h，完畢后向所述培養(yǎng)皿中添加細(xì)胞培養(yǎng)液，然后置于37℃，5％CO₂的培養(yǎng)箱中，進(jìn)行第一次原代貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)至第10～12天，先加入TrypLE^TMExpress進(jìn)行消化，再加入細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，收集得到第一次原代種子細(xì)胞；

(2)將經(jīng)過(guò)第一次原代貼壁培養(yǎng)后的組織塊置于含有細(xì)胞培養(yǎng)液的新的培養(yǎng)皿中，然后置于37℃，5％CO₂的培養(yǎng)箱中進(jìn)行第二次原代貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)至第6～8天，先加入TrypLE^TMExpress進(jìn)行消化，再加入細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，收集得到第二次原代種子細(xì)胞；

(3)將第一次原代種子細(xì)胞與第二次原代種子細(xì)胞合并，得到總的原代種子細(xì)胞；將原代種子細(xì)胞接種至含有細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，然后置于37℃，5％CO₂的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)至80～90％融合時(shí)，先加入TrypLE^TMExpress進(jìn)行消化，再加入細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，然后分種至新的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，經(jīng)數(shù)次所述傳代培養(yǎng)，得到純化的人源臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；

所述細(xì)胞培養(yǎng)液的原料組分為：DMEM+2％血清替代物+2～10ng/mlVEGF+2～10ng/mlBFGF+2mmol/L L-Gln。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(1)中，所述組織塊的大小為1mm³，進(jìn)行所述第一次原代貼壁培養(yǎng)的組織塊與細(xì)胞培養(yǎng)液之間的體積比為1:1～1:2；所述TrypLE^TMExpress的加入量為0.02～0.06mL/cm²，所述消化的溫度為37℃，所述消化的時(shí)間為2～5min，進(jìn)行所述消化至細(xì)胞呈圓球狀，進(jìn)行所述終止消化的細(xì)胞培養(yǎng)液的加入量為0.02～0.06mL/cm²。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(2)中，進(jìn)行所述第二次原代貼壁培養(yǎng)的組織塊與細(xì)胞培養(yǎng)液之間的體積比為1:1～1:2；所述TrypLE^TMExpress的加入量為0.02～0.06mL/cm²，所述消化的溫度為37℃，所述消化的時(shí)間為2～5min，進(jìn)行所述消化至細(xì)胞呈圓球狀；進(jìn)行所述終止消化的細(xì)胞培養(yǎng)液的加入量為0.02～0.06mL/cm²。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(3)中，所述接種密度為2～3×10⁴個(gè)/cm²；所述原代種子細(xì)胞與所述細(xì)胞培養(yǎng)液之間的比例為2～3×10⁴:0.2；所述TrypLE^TMExpress的加入量為0.02～0.06mL/cm²，所述消化的溫度為37℃，所述消化的時(shí)間為2～5min，進(jìn)行所述消化至細(xì)胞呈圓球狀；所述終止消化的細(xì)胞培養(yǎng)液的加入量為0.02～0.06mL/cm²；所述分種的分種率為1:3～1:6。

5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述方法制備得到的人源臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

6.一種權(quán)利要求5所述人源臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)向人源臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中加入TrypLE^TMExpress進(jìn)行消化，然后加入細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，完畢后離心棄去上清，加入無(wú)血清凍存液重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞密度，得到細(xì)胞懸液；

(2)將細(xì)胞懸液分裝至凍存管中，降溫至-80℃，保持24～72h，然后轉(zhuǎn)移至液氮中保存。