[發明專利]麥長管蚜不同溫度下穩定表達的內參基因的篩選方法及應用

在審

• 申請號: 201910608032.2
• 申請日: 2019-07-08
• 公開（公告）號: CN110734959A
• 公開（公告）日: 2020-01-31
• 發明（設計）人: 朱勛;閻維巍;李祥瑞;張云慧;程登發;李新安;龔培盼;任智萌;王超;魏長平;楊超霞;李亞萍;殷新田
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/6809
• 分類號: C12Q1/6809;C12Q1/6888
• 代理公司: 11039 北京知本村知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 劉江良

1.一種不同溫度處理下麥長管蚜內參基因的篩選方法，其特征在于：以20℃飼養的麥長管蚜為對照，設置3個溫度梯度對麥長管蚜成蟲進行處理，處理后立刻提取總RNA，反轉錄合成cDNA，然后進行實時熒光定量PCR驗證，采用RefFinder進行內參基因穩定性分析，從而篩選出在不同溫度處理下麥長管蚜體內最適合、最穩定表達的內參基因。

2.根據權利要求1所述的不同溫度處理下麥長管蚜內參基因的篩選方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）麥長管蚜飼養：麥長管蚜為實驗室飼養種群，飼養與人工氣候箱中，飼養條件是20±2℃，濕度60-80%，光照為16h光照：8h黑暗；

（2）設置3個溫度梯度對麥長管蚜成蟲進行處理，分別是18℃、24℃和30℃；

（3）設計基因的熒光定量引物：從GneBanck數據和麥長管蚜轉錄組中獲得麥長管蚜ACT、RpS27S、v-ATPase、NADH、18S和EF1a候選內參基因和熱激蛋白HSP90的核酸部分序列，利用UNAFold在線軟件分析各基因核酸部分序列的二級結構，軟件設置如下：meltingtemperature，60 ℃；DNA sequence，linear；Na+ concentration，50 mM；Mg²⁺concentration，3 mM；其它選項為初始設置；獲得各基因模板序列含有莖環結構的位點后，利用NCBI-Primer-BLAST在線軟件設計引物，軟件設置如下：primer meltingtemperature，57-63 ℃；primer GC content，40-60%；PCR product size，150-300 basepairs；Excluded regions，莖環結構位點；其它選項為初始設置；設計獲得各基因的特異性實時熒光定量PCR引物，并利用定量PCR溶解曲線法確定其擴增特異性及按5倍稀釋cDNA分別進行定PCR建立標準曲線，確立每對引物的擴增效率；

（4）分別選取18℃、24℃和30℃處理麥長管蚜24小時無翅麥長管蚜為實驗材料，提取總RNA，以試劑盒自帶混合引物為反應引物進行RT反應，以產物第一鏈cDNA作為模板進行熒光定量PCR擴增，熒光染料為SYBR Green 1；

（5）將熒光定量PCR實驗數據輸入到RefFinder軟件進行內參基因穩定性分析。

3.根據權利要求2所述的不同溫度處理下麥長管蚜內參基因的篩選方法，其特征在于步驟（4）熒光定量PCR擴增的反應條件和程序分別為：

熒光定量PCR擴增的反應條件：10×PCR Buffer 2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2.0μL，25.0mmol/L MgCl₂ 2.0μL，5.0U/μL TaqDNA聚合酶 0.5μL，10.0μM上、下游引物各1.0μL，cDNA2.5μL，ddH₂O補足至25μL；

熒光定量PCR擴增的反應程序：95℃預變性15min后；先運行40個循環的95℃變性10sec，60℃退火32sec，再運行溶解曲線階段的95℃ 15sec，60℃ 1min，95℃ 30sec，60℃15sec；每個樣本均設置4個定量PCR重復。

4.根據權利要求2所述的不同溫度處理下麥長管蚜內參基因的篩選方法，其特征在于所述候選內參基因和熱激蛋白hsp90基因的引物分別具有以下堿基序列：

。

5.根據權利要求1所述篩選方法在利用熒光定量PCR技術研究溫度處理相關基因的表達與功能方面的應用。

6.權利要求6所述的應用，其特征在于：以不同溫度處理下的麥長管蚜為樣本，以麥長管蚜熱激蛋白hsp90為目的基因，篩選出的基因為內參基因探討hsp90在麥長管蚜溫度處理下的表達規律。

7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于：所述溫度處理麥長管蚜各處理溫度是18℃、24℃和30℃，處理時間均為24小時。

8.NADH基因作為不同溫度處理下麥長管蚜實時熒光定量PCR分析中的內參基因。