[發明專利]一種六氟異丙醇預處理輔助酶法降解幾丁質生產N-乙酰氨基葡萄糖的方法

在審

• 申請號: 201910606447.6
• 申請日: 2019-07-05
• 公開（公告）號: CN110241157A
• 公開（公告）日: 2019-09-17
• 發明（設計）人: 陳可泉;張阿磊;楊賽;莫曉芳;王瑩瑩;周寧;歐陽平凱
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12P19/26
• 分類號: C12P19/26;C12N9/42;C12R1/01
• 代理公司: 南京先科專利代理事務所(普通合伙) 32285
• 代理人: 葉帥東

1.一種六氟異丙醇預處理輔助酶法降解幾丁質生產N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1，微生物發酵產幾丁質酶，并獲得濃縮酶液

將Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1 菌株接種到種子液培養基中，37℃、200rpm 下培養 12 h，再以體積分數 5% 的接種量接入裝有產酶發酵培養基的搖瓶中，在溫度為 26℃，轉速為 200rpm，初始 pH7.5 下發酵 72 h 后收集發酵液；將獲得的發酵液在4℃離心機中8000g離心，分離菌體，收集上清液，得到幾丁質粗酶液，將粗酶液在旋轉蒸發儀上抽真空濃縮，濃縮2-3h，得濃縮酶液；

步驟2，六氟異丙醇對幾丁質進行預處理

將粒徑為20-100目的幾丁質粉末與體積濃度為50-100%的六氟異丙醇混合后，恒溫加熱至60-80℃，加熱時間10-120分鐘；

步驟3，預處理后的洗滌

對經預處理后的幾丁質粉末中加入純化水，6000-12000rpm的轉速下離心處理后倒去上清，重復離心操作3-4次，再向幾丁質沉淀中加入純水得幾丁質懸浮液；

步驟4，幾丁質酶降解預處理后的幾丁質

將幾丁質懸浮液中加入濃縮酶液，恒溫水浴鍋中37℃下反應30-120min后，再按照1:1的添加量加入二硝基水楊酸（DNS），沸水煮5min，冷卻后觀察體系顏色變化，12000rpm離心2min并測定其還原糖的含量。

2.根據權利要求1所述的一種六氟異丙醇預處理輔助酶法降解幾丁質生產N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，步驟1和步驟2中反應體系中加有占其體積分數為0.1-0.2%的抗生素。

3.根據權利要求2所述的一種六氟異丙醇預處理輔助酶法降解幾丁質生產N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述抗生素為卡納或四環素。

4.根據權利要求1所述的一種六氟異丙醇預處理輔助酶法降解幾丁質生產N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，步驟4加入的濃縮酶液與幾丁質懸浮液按體積比2：8加至1mL，反應體系在5mLPE管中。

5.根據權利要求1所述的一種六氟異丙醇預處理輔助酶法降解幾丁質生產N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述種子液培養基的成分為2 g/L 葡萄糖，2 g/L 蛋白胨，0.7g/L KH₂PO₄，0.3 g/L K₂HPO₄·3H₂O，0.4 g/LMgSO₄·7H₂O，pH7.0。

6.根據權利要求1所述的一種六氟異丙醇預處理輔助酶法降解幾丁質生產N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述產酶發酵培養基的成分為3 g/L 粉粒幾丁質，3 g/L 菊粉，3 g/L 尿素，0.7 g/L KH₂PO₄，0.3 g/L K₂HPO₄·3H₂O ，0.5 g/LMgSO₄·7H₂O。

7.根據權利要求1所述的一種六氟異丙醇預處理輔助酶法降解幾丁質生產N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，步驟2中幾丁質粉末的粒徑為100目。