[發(fā)明專(zhuān)利]一種高產(chǎn)蘇氨酸的基因工程菌及其應(yīng)用方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910599466.0
• 申請(qǐng)日: 2019-07-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110317767B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-01-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王小元;王建莉;馬文漸;方宇;趙磊;董笑飛;詹依
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/21
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/21;C12N15/70;C12P13/08;C12P7/62;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽(yáng)光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 彭素琴

本發(fā)明公開(kāi)了一種高產(chǎn)蘇氨酸的基因工程菌及其應(yīng)用方法，屬于基因工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域。所述基因工程菌為T(mén)WF001/pFW01?phaCAB，在三氯生表達(dá)質(zhì)粒pFW01上過(guò)表達(dá)了phaCAB，可以在胞外合成蘇氨酸，胞內(nèi)合成PHB。本發(fā)明構(gòu)建的菌株蘇氨酸合成量大大提高，在搖瓶發(fā)酵水平產(chǎn)量為17.0g/L，在3?L罐發(fā)酵水平，合成蘇氨酸產(chǎn)量為96.4g/L，在10L罐發(fā)酵水平，合成蘇氨酸產(chǎn)量為133.5g/L。所述基因工程菌為T(mén)WF001/pFW01?phaCAB生長(zhǎng)狀況良好，未引入外源抗性基因序列，更有利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)蘇氨酸的基因工程菌及其應(yīng)用方法，屬于基因工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域。

技術(shù)背景

作為8種必需氨基酸之一，L-蘇氨酸是豬飼料的第二限制氨基酸和家禽飼料的第三限制氨基酸。以添加了蘇氨酸的低蛋白配方飼料作為家禽日糧，不但降低了飼喂成本，還有利于家禽吸收，可促進(jìn)家禽的生長(zhǎng)。除了可以緩解天然蛋白質(zhì)的匱乏，家禽飼料營(yíng)養(yǎng)配比合理還可以有效減少動(dòng)物氨的排放，從而減少環(huán)境污染，有利于社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展。此外，L-蘇氨酸在食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域的用量也呈長(zhǎng)期穩(wěn)定增長(zhǎng)趨勢(shì)。在食品領(lǐng)域，L-蘇氨酸是各類(lèi)氨基酸保健飲品的配方成分，也是重要的食品強(qiáng)化劑，可以與其他氨基酸共用起到抗氧化的作用，還可以與葡萄糖共熱產(chǎn)生焦香味。在醫(yī)藥領(lǐng)域，L-蘇氨酸有促進(jìn)人體生長(zhǎng)發(fā)育、促進(jìn)骨髓T淋巴細(xì)胞前體分化發(fā)育成為成熟T淋巴細(xì)胞和抗脂肪肝的藥用療效，因此在臨床方面有著廣泛的應(yīng)用。此外，L-蘇氨酸還是制造高效低過(guò)敏的抗生素單酰胺菌素等藥物的中間體。在化妝品領(lǐng)域，L-蘇氨酸的分子具有羥基結(jié)構(gòu)，因此可用作保濕劑。

蘇氨酸的工業(yè)生產(chǎn)方法主要有蛋白水解、化學(xué)合成和微生物發(fā)酵。相對(duì)于前兩種方法，發(fā)酵法優(yōu)點(diǎn)是原料便宜、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小、效率高等。大腸桿菌由于其遺傳背景清楚，基因操作簡(jiǎn)單，發(fā)酵周期短等優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)生產(chǎn)飼料添加級(jí)蘇氨酸中占主要地位。

由于目前蘇氨酸生產(chǎn)高產(chǎn)菌是大腸桿菌，大腸桿菌雖生長(zhǎng)迅速發(fā)酵周期短，但是轉(zhuǎn)化率也并不高。該工業(yè)化生產(chǎn)的出發(fā)菌株，目前利用葡萄糖生產(chǎn)蘇氨酸經(jīng)濟(jì)效益最好，但是轉(zhuǎn)化率低，搖瓶作為對(duì)照時(shí)，轉(zhuǎn)化率為40％。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提高該菌株的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率，并建立一種在大腸桿菌里高產(chǎn)蘇氨酸的方法，同時(shí)這種方法可以運(yùn)用到不同的產(chǎn)品生產(chǎn)。

本發(fā)明第一個(gè)目的是提供一株高產(chǎn)蘇氨酸的基因工程菌，所述菌株以具有蘇氨酸生產(chǎn)能力的菌株為出發(fā)菌株，過(guò)表達(dá)了來(lái)自羅氏真養(yǎng)菌基因組的phaCAB基因簇。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因工程菌以大腸桿菌TWF001為出發(fā)菌株，以質(zhì)粒pFW01為表達(dá)質(zhì)粒；所述TWF001和pFW01公開(kāi)于2018年的論文《Increasing l-threonine production in Escherichia coli by engineering the glyoxylate shuntand the l-threonine biosynthesis pathway》。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因工程菌是在大腸桿菌TWF001中，過(guò)表達(dá)了來(lái)自羅氏真養(yǎng)菌基因組的phaCAB基因簇，該基因簇如GenBank登錄號(hào)MH558939.1所示核苷酸序列。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方法中，基因phaA、phaB和phaC分別編碼的β-酮硫解酶，乙酰乙酰輔酶A還原酶和PHB合成酶，在大腸桿菌中可以以乙酰輔酶A為底物合成β-聚3-羥基丁酸酯(PHB)。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供所述基因工程菌的構(gòu)建方法，是將所述phaCAB基因簇與表達(dá)載體連接，在大腸桿菌宿主細(xì)胞中表達(dá)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述表達(dá)載體為pFW01。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌TWF001。