[發明專利]一種同位素稀釋質譜法測定血清miR-224含量的方法

有效

• 申請號: 201910599052.8
• 申請日: 2019-07-04
• 公開（公告）號: CN110220994B
• 公開（公告）日: 2022-02-18
• 發明（設計）人: 王峰;季伙燕;吳安琪;李袆;鞠少卿;王建新;沈蕾
• 申請（專利權）人: 南通大學附屬醫院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/08
• 代理公司: 南通毅帆知識產權代理事務所(普通合伙) 32386
• 代理人: 任毅

1.一種同位素稀釋質譜法測定miR-224含量的方法，包括如下步驟：

（1）將合成的miR-224核酸單鏈配成溶液，用于建立標準曲線；

（2）合成核酸肽探針配成溶液，用以捕獲miR-224；

（3）將合成的同位素標記多肽配成溶液作為內標；

（4）在血清樣本中提取miRNA；

（5）將提取出來的miRNA進行生物素化；

（6）將上述生物素化的miRNA-224與鏈霉素瓊脂糖球反應，形成miRNA-224-生物素-鏈霉親和素瓊脂糖球復合物；

（7）加入核酸肽探針捕獲miR-224-生物素-鏈霉親和素瓊脂糖球復合物；

（8）將核酸肽探針-miR-224-生物素-鏈霉親和素瓊脂糖球復合物清洗干凈后加入胰蛋白酶進行酶解，然后將酶解產物進行固相萃取，將萃取出的多肽吹干并復溶；

（9）將復溶后的多肽和同位素標記的多肽樣品進行質譜分析；

（10）計算血清樣品中miR-224含量；

所述步驟（8）具體包括如下步驟：

①用1mL超純水重新溶解上述核酸肽探針-miR-224-生物素-鏈霉親和素瓊脂糖球復合物；

②加入10μL 1mg/L同位素標記多肽溶液；

③加入10μL 0.04μg/μL胰酶，置于37℃酶解4h；

④將酶解產物用60mg, 3mL Oasis^? MAX cartridges固相萃取柱進行純化富集ALFVGEPNR和A[¹³C₆¹⁵N]LFVGEPNR；Oasis^? MAX cartridges固相萃取柱首先用3mL甲醇和3mL超純水分別活化和平衡柱子，然后加入酶解產物，再用2mL超純水清洗柱子，最后用1mL含0.2%甲酸的乙腈溶液萃取ALFVGEPNR和A[¹³C₆¹⁵N]LFVGEPNR；

⑤將萃取物用氮氣吹干；

⑥吹干后加入250μL 0.1% 甲酸水溶液復溶ALFVGEPNR和A[13C615N]LFVGEPNR多肽混合物；

所述步驟（9）具體包括如下步驟：采用島津Nexera X2高效液相色譜系統和AB Sciex5500三重四級桿液質聯用儀，使用60mg, 3mL的Symmetry Shield^TM RP18色譜柱在40℃條件下進行色譜分離；流動相為：A：含0.1%甲酸的水溶液；B：含0.1%甲酸的乙腈溶液；流速為0.2mL/min；進樣量10μL；按照如下的梯度進行洗脫：B 5%，0-0.1min→B 35%，0.1-6min→B80%，6-6.1min→B 80%，6.1-8min→B 5%，8-8.1min→B 5%，8.1-12min→B 5%；選用正離子多反應監測模式，監測ALFVGEPNR和A[¹³C₆¹⁵N]LFVGEPNR兩條多肽的信號強度；質譜系統的離子源為電噴霧電離源，噴霧電壓5500 V；霧化壓力55 psi；霧化溫度550℃；霧化氣流10 L/min；Q1和Q3質量選擇器均設定在單位質量分辨率；用于定量分析的離子分別為 m/z 501.0→571.5和 m/z 505.5→572.2；碰撞能量CE分別為25eV和23eV；去簇電壓DP為130V；所有數據均通過AB SciexMultiQuant工作站軟件采集和處理；

所述步驟（10）具體包括如下步驟：

①建立標準曲線，用DEPC水將濃度為1μmol/L的miR-224貯存液稀釋成以下系列濃度：1000nmol/L、800nmol/L、500nmol/L、300nmol/L、200nmol/L、100nmol/L、80nmol/L、60nmol/L、40nmol/L、20nmol/L、10nmol/L和5nmol/L，然后按步驟（5）～（9）具體步驟進行操作，采用島津Nexera X2高效液相色譜和AB Sciex 5500三重四級桿液質聯用儀對萃取多肽產物ALFVGEPNR和同位素標記多肽A[¹³C₆¹⁵N]LFVGEPNR的峰面積進行測定，以miR-224濃度為橫坐標（x）、兩條多肽峰面積比（y）為縱坐標建立標準曲線，曲線方程為y=0.0103x+0.2147，R²=0.995；

②收集血清樣本，按步驟（4）～（9）具體步驟進行操作，采用島津Nexera X2高效液相色譜和AB Sciex 5500三重四級桿液質聯用儀對萃取多肽產ALFVGEPNR和同位素標記多肽A[¹³C₆¹⁵N]LFVGEPNR的峰面積進行測定，將二者峰面積比代入上述曲線方程，即可計算得血清樣品中miR-224含量。