[發明專利]分離純化透明質酸的方法

有效

• 申請號: 201910597789.6
• 申請日: 2019-07-04
• 公開（公告）號: CN110577608B
• 公開（公告）日: 2021-09-28
• 發明（設計）人: 石江水;王海剛;林桂梅;黃小龍;肖文龍;馬雷磊;屈代鑫;鮑素敏;鄒兵;謝文平;李文佳
• 申請（專利權）人: 宜昌東陽光生化制藥有限公司
• 主分類號: C08B37/08
• 分類號: C08B37/08
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 趙天月

本發明提出了一種分離純化透明質酸的方法。該方法包括將待處理透明質酸樣品進行硫酸銨分級沉淀處理，以便獲得透明質酸。該方法徹底解決了小分子雜質問題，且制備的透明質酸成品的蛋白殘留可降至0.025％以下，極大提高了產品質量與市場競爭力。

技術領域

本發明涉及生物領域，具體地，本發明涉及分離純化透明質酸的方法。

背景技術

透明質酸(hyaluronic acid或hyaluronan,HA)是由葡萄醛酸和氨基葡糖的雙糖重復單位所組成的多糖，廣泛分布于軟骨組織、關節液和皮膚組織的真皮以及表皮中，并在其中起到保濕、營養、修復和預防損傷等生理作用。透明質酸參與許多重要的生物學過程，可廣泛應用于眼科學、整形手術和化妝品等領域。目前，工業上普遍采用弱化溶血性等毒性的C型鏈球菌來生產透明質酸。但由于其遺傳不穩定性和復雜的處理手段，存在著很大的不確定性和潛在的未知因素等一系列問題，給C型鏈球菌發酵生產透明質酸帶來不確定因素。以合成生物學的理論為基礎，以遺傳穩定、背景清晰、生物安全性高的微生物作為底盤細胞，利用基因工程方法，構建新的代謝途徑，使其能夠合成透明質酸，逐漸成為微生物法合成透明質酸的研究方向。枯草芽孢桿菌作為基因工程菌具有超強穩定性的重組表達質粒、不產致熱致敏蛋白和毒素、超強的分泌系統合成產物可以通過特殊機制輸送到胞外、不存在外源基因序列含有的稀有密碼子而導致表達量低或提前終止翻譯等情況、發酵條件簡單等優勢。因而得到普遍廣泛的應用。

透明質酸含量與蛋白雜質殘留是產品的關鍵指標，對產品的應用起非常關鍵的作用，特別是在醫藥及醫美上的應用。對此，醫用級透明質酸對含量與蛋白等雜質殘留有明確嚴格的要求，如歐洲藥典要求透明質酸含量應不低于95.0％，日本藥典要求蛋白殘留不超過0.05％。枯草芽孢桿菌在表達透明質酸的同時，相應的會產生與目標物性質相似的雜質，如發酵未反應完的殘糖、小分子雜糖、蛋白質、核酸、細胞碎片等，這些雜質影響最終透明質酸含量與產品質量。目前針對枯草芽孢桿菌發酵液中分離純化透明質酸相關報道較少。如專利CN1662656A公布的二價鹽絮凝純化枯草芽孢桿菌發酵液中透明質酸的方法，該方法敘述的是一種發酵液的預處理方法，可以有助于降低大分子顆粒及懸浮物含量，提高發酵液的后續精制純化效率，但不能從根本上解決發酵液中小分子雜質及蛋白殘留的問題。

因此，如何從根本上解決透明質酸中小分子雜質和蛋白殘留的問題，是科研工作者拭待解決的關鍵問題。

發明內容

本申請是基于發明人對以下事實和問題的發現和認識作出的：

發明人在分離純化透明質酸的方法的開發過程中，意外地發現，采用硫酸銨對透明質酸溶液進行分級沉淀，可以大大降低透明質酸中的蛋白和小分子殘留。一方面，針對水溶性較差的雜質，醇沉后的復溶液中加入硫酸銨至一定濃度，可使溶液中的這部分雜質如蛋白、核酸等溶解度降低而沉淀析出，沉淀析出后再通過過濾即可去除。另外一方面，水溶性較好的雜質，通過進一步加大硫酸銨濃度至透明質酸鈉完全沉淀析出，而大部分雜質在此條件下存在于上清液中，從而實現與水溶性更大的雜質分離。通過硫酸銨分級沉淀處理枯草芽孢桿菌發酵液，可徹底解決小分子雜質問題，且制備的透明質酸成品的蛋白殘留可降至0.025％以下，極大提高了產品質量與市場競爭力。

在本發明的第一方面，本發明提出了一種分離純化透明質酸的方法。根據本發明的實施例，所述方法包括將待處理透明質酸樣品進行硫酸銨分級沉淀處理，以便獲得透明質酸。根據本發明實施例的方法，徹底解決了小分子雜質問題，且制備的透明質酸成品的蛋白殘留可降至0.025％以下，極大提高了產品質量與市場競爭力。

根據本發明的實施例，所述方法還可以進一步包括如下附加技術特征至少之一：

根據本發明的實施例，所述分級沉淀處理包括至少兩級沉淀處理。進而可通過調節硫酸銨在分級沉淀體系中的濃度，實現溶解度較低的大分子雜質和溶解度較大的小分子雜質與透明質酸的分離。