[發明專利]堿性蛋白酶PA3及其編碼基因和應用

在審

• 申請號: 201910596971.X
• 申請日: 2019-07-03
• 公開（公告）號: CN110343688A
• 公開（公告）日: 2019-10-18
• 發明（設計）人: 羅會穎;任雅馨;涂濤;王亞茹;黃火清;蘇小運;柏映國;王苑;張杰;姚斌
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院飼料研究所
• 主分類號: C12N9/58
• 分類號: C12N9/58;C12N15/57;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 北京法信智言知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11737
• 代理人: 劉靜榮

本發明屬于農業生物技術領域，具體涉及堿性蛋白酶PA3及其編碼基因和應用。本發明提供了Torrubiella hemipterigena來源的堿性蛋白酶PA3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，其具有良好的性質，可應用于食品、飼料、制革、洗滌、醫藥等多個領域。根據本發明的技術方案可以實現利用基因工程手段生產性質優良、適合工業應用的堿性蛋白酶PA3。

技術領域

本發明屬于農業生物技術領域，具體涉及堿性蛋白酶PA3及其編碼基因和應用。

背景技術

蛋白酶指通過切割肽鍵實現蛋白質水解的一類酶，其來源十分廣泛，大量分布于動物、植物、微生物中。相比于動植物來源的蛋白酶，微生物源蛋白酶具有培養方便、操作簡單和產酶量高等便于工業化的批量生產的特點，因此，微生物源蛋白酶成為了目前的蛋白酶的重要來源。蛋白酶在細胞代謝過程中發揮著至關重要的作用，大量生理活動依靠蛋白酶執行，此外蛋白酶還具有工業應用特性，作為最主要的工業酶制劑之一，被廣泛應用于各個領域，市場需求大，經濟價值高。

以最適pH為標準，蛋白酶分為酸性蛋白酶、堿性蛋白酶及中性蛋白酶。其中堿性蛋白酶在蛋白酶制劑總銷量中占比最大。堿性蛋白酶的最適pH在pH7.5-11.0之間均有分布，且通常在偏堿環境中保持穩定，少數堿性蛋白酶在酸性條件下也有一定的耐受性。堿性蛋白酶的蛋白分子量通常在18-34kDa。工業用堿性蛋白酶主要來源于桿菌屬，例如枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等。目前已發現的堿性蛋白酶基本為絲氨酸蛋白酶，由于活性中心存在一個絲氨酸，當存在苯甲基磺酰氟(PMSF)、二異丙基磷酰氟(DFP)等抑制劑時，其活性被抑制。該類酶通常對位于芳香族氨基酸羧基端的肽鍵優先作用。常見的堿性蛋白酶有胰蛋白酶、枯草桿菌類蛋白酶等。

直接利用野生菌株發酵生產堿性蛋白酶存在產酶水平低、性質不穩定、分離純化麻煩等缺點。隨著基因工程技術的發展，許多優質的表達系統被建立以實現目標蛋白的高效表達。目前已成功構建蛋白表達系統有大腸桿菌表達系統、酵母表達系統、枯草芽孢桿菌表達系統、昆蟲表達系統和哺乳動物表達系統等。其中畢赤酵母表達系統以其表達局限性小、產量高、可控性強、產品投入少、產物易分離及純化效果好等特點成為備受青睞的表達系統，尤其是對于真菌來源的目的蛋白，其具有完善的翻譯后修飾功能。利用畢赤酵母表達真菌來源的堿性蛋白酶有利于其工業化大規模生產，便于其更好地發揮應用價值。利用畢赤酵母表達外源基因時，對基因按照畢赤酵母偏好性進行密碼子優化，目前，雖然現有技術根據不同的方法計算了畢赤酵母中密碼子偏好性并且提出了偏好密碼子和稀有密碼子，但是對于部分氨基酸的偏好密碼子的結果存在差異，因此在選擇時，需結合外源基因的具體情況和宿主細胞類型，進行具體分析。在密碼子優化過程中，除將稀有密碼子替換成偏好密碼子外，還需注意調整基因局部區域大AT含量，避免使轉錄提前終止；并且還需提高翻譯終止效率，同時，去除不利于mRNA穩定的序列及二級結構，以提高整體的翻譯效率，促進表達。因此，利用畢赤酵母表達外源基因時，僅進行偏好密碼子替換并不能獲得預期結果，需綜合考慮基因、宿主細胞等因素。

發明內容

本發明的目的在于提供一種堿性蛋白酶PA3。

本發明的再一目的在于提供上述堿性蛋白酶PA3的編碼基因。

本發明的再一目的在于提供含有上述基因的重組表達載體。

本發明的再一目的在于提供含有上述基因重組菌株。

本發明的再一目的在于提供上述堿性蛋白酶PA3的制備方法。

本發明的再一目的在于提供上述堿性蛋白酶PA3的應用。

根據本發明具體實施方式的堿性蛋白酶PA3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：