[發明專利]一種基因測序試劑及方法

有效

• 申請號: 201910596524.4
• 申請日: 2019-07-03
• 公開（公告）號: CN112176042B
• 公開（公告）日: 2023-10-17
• 發明（設計）人: 陳子天;劉燕;喬朔;李文濤;翟志向
• 申請（專利權）人: 賽納生物科技(北京)有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 北京嘉途睿知識產權代理事務所(普通合伙) 11793
• 代理人: 彭成

本發明提供一種基因測序試劑及方法。通過在測序反應液中添加一種或多種添加劑來提高測序反應速率和反應完成度，增加測序的準確性和測序讀長。所述的添加劑包括亞精胺其類似物或衍生物、三甲基胺及其類似物或衍生物，或其混合物。

技術領域

本發明屬于基因測序領域。具體來說，本發明涉及適基因測序的方法和試劑。

背景技術

二代測序技術目前占據測序的主流市場，進一步提高測序的讀長和準確率仍然是研究者不斷追求的目標。陳等(nat.biotechnol.,2017)通過糾錯編碼(error-correctioncode,ECC)測序法顯著提高了測序的準確率。該方法是將ACTG四種堿基通過三種正交方式兩兩組合：一種組合為M(氨式)＝A+C和K(酮式)＝G和T,一種組合為R(嘌呤)＝A+G和Y(吡啶)＝C+T，一種組合為W(雙鍵)＝A+T和S(三鍵)＝C+G。DNA片段通過MK和RY兩個循環的測序后能夠解析出其序列，第三個循環的WS組合的測序能對結果作進一步的復驗和校正。

在ECC反應過程中，每次DNA的聚合酶延伸反應是延伸兩種堿基(如進液為M則延伸A堿基和C堿基)，每次堿基延伸個數從1到10余個不等。測序反應過程中保證每一次DNA的聚合酶延伸反應的完成度是實現高保真度和長讀長的關鍵。其反應效率、反應時間、組分的含量都需要精確優化。而在較短反應時間內，保證多個堿基延伸反應完全是一個挑戰。單一地提高組分的含量或延長反應時間會引起錯配或lead，同時反應速率會達到平臺后也不再增加。本專利通過添加亞精胺(spermidine)和三甲基胺(TMANO)及其類似物、衍生物或其混合物的方法，顯著提高了聚合酶延伸的反應效率和反應完成度，增加了測序讀長。

發明內容

本發明提供一種基因測序試劑，其特征在于，包括兩種或者兩種以上的核苷酸測序底物，還包括有機胺；其中所述有機胺為亞精胺或其衍生物，和/或三甲基胺或其衍生物；所述核苷酸測序底物為熒光標記的核苷酸底物分子。

根據優選的實施方式，所述核苷酸測序底物為具有熒光切換性質的核苷酸底物分子，5’末端磷酸修飾有熒光團，優選地為5’末端有4-8個磷酸分子的熒光團。

根據優選的實施方式，所述有機胺的濃度為10μM至100mM。

本發明提供一種基因測序的方法，其特征在于，在測序反應液中添加一種或多種添加劑，其中所述添加劑能夠提高測序反應的反應速率，增加測序檢測結果的準確性和測序讀長；所述的添加劑包括亞精胺及其類似物或衍生物、三甲基胺及其類似物或衍生物，或其混合物。

根據優選的實施方式，其中所述亞精胺其類似物或衍生物、三甲基胺其類似物或衍生物、或其混合物的濃度為10μM至100mM。

根據優選的實施方式，所述測序反應特征在于兩種或三種不同堿基的核苷酸底物分子同待測基因序列進行反應，不同堿基的核苷酸底物分子可以用同一種或不同種熒光團標記

本發明提供一種基因測序試劑，其特征在于，包括核苷酸測序底物，有機胺；其中所述有機胺為亞精胺或其衍生物，和/或三甲基胺或其衍生物；所述核苷酸測序底物為熒光標記的核苷酸底物分子。

本發明所述添加劑加入到測序反應液中用于測序反應，與不存在所述添加劑的測序反應相比，測序反應速率明顯增加，反應速率提高大于10％、40％或80％。不含添加劑的對照反應中，較慢的反應速率會導致多個堿基延伸的反應不完全，尤其是5個甚至10個以上長homopolymer的堿基延伸反應。反應的不完全會影響測序的保真度和準確性，進而影響測序讀長。而通過增加測序反應液中酶，底物分子等各組分的濃度以及延長反應時間，很難進一步提高測序反應速率及反應完成度，且很容易導致錯配概率的提高以及lead的發生。此外，所述添加劑還可能具有其他提高測序質量的功能，比如減少GC歧視等。

附圖說明