[發明專利]一種基于外切酶的寡核苷酸純化方法

在審

• 申請號: 201910592848.0
• 申請日: 2019-07-03
• 公開（公告）號: CN112175940A
• 公開（公告）日: 2021-01-05
• 發明（設計）人: 林繼偉;王洪琦
• 申請（專利權）人: 華大青蘭生物科技（無錫）有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京華睿卓成知識產權代理事務所(普通合伙) 11436
• 代理人: 唐莉

1.一種基于外切酶的寡核苷酸純化方法，包括以下步驟：

(1)在目標寡核苷酸的5‘端或3’端增加一段輔助序列，所述輔助序列是與目標寡核苷酸互補的DNA序列，能與目標寡核苷酸形成發夾結構；

(2)合成上述設計的寡核苷酸，此寡核苷酸被稱為引物；

(3)用單鏈外切酶處理引物；

(4)高溫滅活外切酶，得到的溶液直接用于下游操作；或者將外切酶處理后的溶液直接用其它方法純化后用于下游操作；

其中所述單鏈外切酶是只作用于DNA單鏈的水解酶，其活性是從DNA的5’端或3‘端水解DNA，而不會從DNA序列內部水解DNA，也不會水解DNA雙鏈；

其中所述用單鏈外切酶處理引物，是在一定的反應條件下，所述外切酶將非目標寡核苷酸水解而只留下目標寡核苷酸的過程。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述目標寡核苷酸是在下游操作中發揮功能作用的DNA單鏈。

3.根據權利要求1所述的方法，其中所述輔助序列與目標寡核苷酸部分互補或者完全互補，所述部分互補是輔助序列與目標寡核苷酸的一部分序列互補，所述完全互補是輔助序列與目標寡核苷酸的全部序列互補。

4.根據權利要求1或3所述的方法，其中所述輔助序列與目標序列之間的互補是不完美互補或完美互補，所述不完美互補是輔助序列與目標寡核苷酸之間的互補不完全符合堿基配對原則，所述完美互補是輔助序列與目標寡核苷酸之間的互補完全符合堿基配對原則；優選地，所述堿基配對原則是指符合堿基A與堿基T配對，堿基G與堿基C配對。

5.根據權利要求1或3所述的方法，其中：

所述單鏈外切酶是5’-3‘作用的DNA單鏈外切酶，所述輔助序列被增加在目標寡核苷酸的5‘端，輔助序列與目標寡核苷酸在引物的5‘端形成發夾結構，此結構不會被5’-3‘作用的DNA單鏈外切酶降解，而沒有形成該發夾結構的寡核苷酸會被其降解；

或者，所述單鏈外切酶是3’-5‘作用的DNA單鏈外切酶，所述輔助序列被增加在目標寡核苷酸的3’端，輔助序列與目標寡核苷酸在引物的3‘端形成發夾結構，此結構不會被3’-5‘作用的DNA單鏈外切酶降解，而沒有形成該發夾結構的寡核苷酸會被其降解。

6.根據權利要求1所述的方法，其中所述引物是用DNA合成儀合成的單鏈寡核苷酸。

7.根據權利要求1所述的方法，其中所述高溫滅活是在50-100攝氏度之間處理反應體系一段時間，使外切酶失去其原有活性，從而使外切酶不會干擾下游操作。

8.根據權利要求1所述的方法，其中所述下游操作是使用寡核苷酸實現不同應用目的的操作；優選地，所述操作是基因合成、聚合酶鏈式反應核酸擴增、引物探針或DNA測序；更優選地，所述下游操作是等溫雙向延伸法基因合成。

9.根據權利要求1所述的方法，其中所述其它方法純化是用不同的方法將寡核苷酸從混合物中分離的操作；所述操作優選是乙醇沉淀回收、silica吸附回收或PEG沉淀回收。

10.根據權利要求5所述的方法，其中：

所述5’-3‘作用的DNA單鏈外切酶是只作用于DNA單鏈的5’-3‘外切酶，特別是RecJ和RecJf單鏈外切酶；

所述3’-5‘作用的DNA單鏈外切酶是只作用于DNA單鏈的3’-5‘外切酶，特別是exonuclease I。