[發(fā)明專利]一種促進生物素合成的方法、促進生物素合成的重組細胞和基因工程菌

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910585879.3
• 申請日: 2019-07-01
• 公開（公告）號: CN112176010B
• 公開（公告）日: 2022-09-30
• 發(fā)明（設計）人: 徐志南;朱勇剛;周斌;肖峰
• 申請（專利權）人: 浙江圣達生物藥業(yè)股份有限公司
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12N1/21;C12R1/38;C12R1/40
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 劉曉春

本發(fā)明公開了一種促進生物素合成的方法，促進生物素合成的重組細胞和基因工程菌，該方法通過引入枯草芽孢桿菌168(Bacillus subtilis 168)來源的編碼庚二酸輔酶A合成酶基因bioW和能夠裂解長鏈脂肪酰基?ACP的P450氧化酶基因bioI來強化生物素前體庚二酸硫酯的供應，促進下游生物素合成基因bioAFDB對生物素的合成。通過本發(fā)明，獲得的工程菌生物素合成能力得到了極大的提升，在添加少量庚二酸的情況下，上罐分批發(fā)酵產(chǎn)生了80mg/L生物素，其產(chǎn)量是野生型易變假單胞菌的8000倍。

技術領域

本發(fā)明屬于基因工程領域，涉及通過微生物發(fā)酵促進生物素生產(chǎn)的方法，相關的DNA序列及用這種方法的質(zhì)粒。

背景技術

D-生物素(維生素H)作為涉及細胞中心代謝路徑最重要的輔酶之一，在脂質(zhì)生成、氨基酸代謝和糖質(zhì)新生過程中發(fā)揮重要作用，是動物、植物和微生物生長的必需維生素，其在生物醫(yī)藥、化妝品、食品、飼料等方面具有極大的市場應用前景。

生物素合成可分為生物合成法和化學合成法，化學合成法是目前工業(yè)上主要采用的生物素合成方法。化學合成法的缺點主要為成本高、工藝復雜、環(huán)境負擔過重。我國雖已能利用化學合成制備生物素，但由于生物素產(chǎn)品純度低、價格高，不得不從美國、日本等國家進口。采用生物法制備生物素可解決化學法制備帶來的環(huán)境污染問題，符合可持續(xù)發(fā)展原則，且其生產(chǎn)工藝較化學法更簡潔。

已有許多關于生物素發(fā)酵生產(chǎn)的研究。例如，球形芽孢桿菌(Bacillussphaericus)(Agr Biol Chem,1983,47(5):1011-1016)、大腸桿菌(Escherichia coli)(Biosci Biotech Bioch,1993,57(5):760-765)、沙雷氏菌(Serratia marcescens)(ApplEnviron Microbiol,1993,59:2857-2863)和庫特氏菌(Kurthia sp.)(United StatesPatent 5,922,581)經(jīng)誘變和生物素類似物篩選，分別能夠產(chǎn)生9.5mg/L、11.1mg/L、20mg/L和126mg/L生物素。

近年來，生物素生物合成路徑中從庚二酸-ACP(或庚二酸-輔酶A)到生物素合成的各酶促反應步驟在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中進行了廣泛研究，這些途徑在所有生物素自養(yǎng)型微生物中都是比較保守的。這些步驟包括如下的轉變過程：(1)庚二酸-ACP(或庚二酸-輔酶A)經(jīng)7-酮基-8-氨基壬酸合成酶(BioF)被轉化成7-酮基-8-氨基壬酸(AON)。(2)AON經(jīng)7，8-二氨基壬酸轉氨酶(BioA)被轉化成7，8-二氨基壬酸(DAN)。(3)DAN經(jīng)脫硫生物素合成酶(BioD)被轉化成脫硫生物素(DTB)。(4)DTB經(jīng)生物素合成酶(BioB)被轉化成生物素。庚二酸-ACP(或庚二酸-輔酶A)的合成至少有兩條不同的路徑，目前研究地比較清楚的是大腸桿菌的BioC-BioH路徑和枯草芽孢桿菌的BioI-BioW的路徑。BioC-BioH路徑借用脂肪酸合成路徑中的多種脂肪酸合成酶生成庚二酸硫酯，BioI-BioW路徑通過游離的庚二酸或脂肪酸長鏈-ACP裂解生成庚二酸硫酯。

隨著基因工程技術的發(fā)展，直接通過基因工程策略來提高生物素產(chǎn)量的方法也被采用。例如，Streit等人將大腸桿菌的生物素操縱子bioABFCD導入到苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)中，生物素產(chǎn)量達到了1mg/L(Appl.Environ.Microb.,1996,62(9):3333-3338)；Saito等人將鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas paucimobilis)生物素操縱子bioABFCD導入到一株生物素高產(chǎn)的野生型鞘氨醇單胞菌中，通過分批補料發(fā)酵產(chǎn)生了66mg/L生物素(Biochem.Eng.J.,2000,5(2):129-136)；Shaw等人將大腸桿菌的生物素基因簇bioABFCD導入根瘤菌(Agrobacterium/Rhizobium)中，經(jīng)20天發(fā)酵生物素水平達到了110mg/L。