[發明專利]一種大豆GmEF1B基因突變體植株及其制備方法及應用

有效

• 申請號: 201910582526.8
• 申請日: 2019-06-28
• 公開（公告）號: CN112143730B
• 公開（公告）日: 2022-09-30
• 發明（設計）人: 鄒佳男
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/82;A01H6/54
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

一種大豆GmEF1B基因突變體植株及其制備方法及應用,屬于植物生物技術領域。為了明確大豆抗核盤菌相關基因的抗病功能，加快大豆抗菌核病品種選育的進程，本發明提供了一種大豆GmEF1B基因突變體植株，所述突變體植株含有突變的大豆GmEF1B基因，所述突變是指GmEF1B基因編碼區中5’?GCTTCCCCGGCAATGCTCAA?3’核苷酸序列發生堿基取代或缺失，使其編碼的氨基酸序列發生改變。所述突變體植株通過CRISPR/Cas9基因編輯方法制備獲得。本發明可用于大豆抗菌核病品種的選育。

技術領域

本發明屬于植物生物技術領域，具體涉及一種大豆GmEF1B基因突變體植株及其制備方法及應用。

背景技術

大豆菌核病是由核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)引起的真菌性病害，是一種危害嚴重的世界性病害，直接影響大豆的品質及產量，病情嚴重時發病率高達50％～90％，甚至絕產。由于傳統育種方法的局限性，利用分子手段篩選及鑒定有效的抗病基因，對抗病品種的選育便顯得尤為重要，然而目前抗病品種培育的基因資源稀少，制約了新品種選育的效率以及準確性。

發明內容

為了明確大豆抗核盤菌相關基因的抗病功能，加快大豆抗菌核病品種選育的進程，本發明提供了一種大豆GmEF1B基因突變體植株，所述突變體植株含有突變的大豆GmEF1B基因，所述突變是指GmEF1B基因編碼區中5’-GCTTCCCCGGCAATGCTCAA-3’核苷酸序列發生堿基取代或缺失，使其編碼的氨基酸序列發生改變；所述大豆GmEF1B基因核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

進一步地限定，所述突變的大豆GmEF1B基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。

本發明還提供了上述大豆GmEF1B基因突變體植株的制備方法，包括如下步驟：

1)根據大豆GmEF1B基因設計gRNA單靶點引物；

2)制備gRNA單靶點引物二聚體；

3)將引物二聚體插入到Cas9/gRNA載體中，構建大豆GmEF1B基因敲除載體；

4)將步驟3)構建的GmEF1B基因敲除載體轉化大豆，經篩選獲得大豆GmEF1B基因突變體植株。

進一步地限定，步驟1)所述大豆GmEF1B gRNA單靶點引物的正向引物為GmEF1B-1-S，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，反向引物為GmEF1B-1-A，其核苷酸序列SEQ ID NO:3所示。

進一步地限定，步驟2)所述制備gRNA單靶點引物二聚體，是指每20uL合成體系中正向引物5μL，正向引物5μL和H₂O 15μL，反應條件為95℃ 3min，冷卻后靜置。

進一步地限定，步驟3)所述構建GmEF1B基因敲除載體，是指每10uL反應體系中，引物二聚體1-7μL，Cas9/gRNA vector，1μL，Solution1 1μL，Solution2 1μL，H₂O 0-6μL，16℃反應5-10h。

進一步地限定，步驟4)所述大豆為大豆品種Maple Arrow；所述農桿菌為農桿菌EHA105。

進一步地限定，步驟4)所述篩選所用正向引物為mutV-S，其核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示，反向引物為mutV-A，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，用于篩選陽性突變體植株。

進一步地限定，步驟4)所述篩選所用正向引物為GmEF1B-target1-S，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，反向引物序列為GmEF1B-target1-A，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，上述兩條引物作為單靶點突變檢測引物，用于檢測利用引物GmEF1B-1-S和GmEF1B-1-A構建獲得的大豆GmEF1B基因突變體植株。