[發(fā)明專利]一種難治性哮喘檢測標(biāo)記物的篩選方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910581607.6
• 申請日: 2019-06-30
• 公開（公告）號: CN110257504A
• 公開（公告）日: 2019-09-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉持;秦嶺;袁琳;秦曉群;向陽;瞿湘萍;劉惠君;杜茜子;伍夢萍;楊雨
• 申請（專利權(quán)）人: 中南大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6869
• 代理公司: 長沙睿翔專利代理事務(wù)所(普通合伙) 43237
• 代理人: 周松華;孫建霞

1.一種難治性哮喘檢測標(biāo)記物的篩選方法，其特征在于：所述難治性哮喘檢測標(biāo)記物為CTSC基因，其按照以下步驟進(jìn)行：

(1)收集臨床明確診斷為哮喘病人及健康對照測試者的誘導(dǎo)痰中原代氣道上皮細(xì)胞：

進(jìn)行細(xì)胞分類和活力檢測，合格標(biāo)準(zhǔn)為上皮細(xì)胞<10個(gè)/低倍鏡視野，白細(xì)胞>25個(gè)/低倍鏡視野，細(xì)胞存活率>40％，篩選鑒定細(xì)胞，采用免疫磁珠分選法進(jìn)行標(biāo)記并進(jìn)一步篩選純化原代氣道上皮細(xì)胞；

(2)mRNA轉(zhuǎn)錄組測序分析：

①進(jìn)一步篩選純化后，加入洗脫、片段化和隨機(jī)引物組成的緩沖液，將磁珠94℃高溫孵育，洗脫結(jié)合的mRNA同時(shí)進(jìn)行熱斷裂，使片段分布在100-300bp之間；以片段化且結(jié)合了隨機(jī)逆轉(zhuǎn)錄引物的短片段mRNA為模板，在Invitrogen逆轉(zhuǎn)錄酶SuperScript IV的作用下進(jìn)行第一鏈cDNA的合成，向合成一鏈cDNA的體系中加入二鏈合成預(yù)混體系，水解消化RNA/cDNA雜合鏈上的RNA，并以一鏈cDNA為模板，DNA聚合酶合成二鏈cDNA，經(jīng)過Agencourt AMpureXP磁珠純化，最終得到雙鏈ds cDNA；

②向純化后的ds cDNA加入末端補(bǔ)齊體系，其是含有修復(fù)cDNA兩端不規(guī)則末端的酶組合，最終得到5’端含有磷酸基團(tuán)的平末端ds cDNA短片段文庫；向上述體系中加入3’末端加“A”緩沖反應(yīng)體系；向上述反應(yīng)體系中加入連接緩沖液和雙鏈測序接頭；

③對于加上接頭的文庫，應(yīng)用Agencourt SPRIselect核酸片段篩選試劑盒在純化文庫的同時(shí)，進(jìn)行片段大小篩選，最終篩選出片段峰值在300bp的原始文庫；

④用聚合酶放大原始文庫，PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)控制在12-15之間，放大后的文庫經(jīng)過磁珠純化即成為可以上機(jī)的測序文庫；

⑤對構(gòu)建好的測序文庫進(jìn)行質(zhì)檢和定量；

⑥對于質(zhì)檢合格的文庫經(jīng)過稀釋后按等摩爾數(shù)對多個(gè)樣品進(jìn)行混樣上機(jī)，對文庫進(jìn)行測序；

⑦對測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，使用tophat2將質(zhì)量控制后的序列和參考基因組進(jìn)行比對，利用cufflinks的分析流程對已知的基因和轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行表達(dá)定量，利用cuffdiff軟件分析差異表達(dá)基因，當(dāng)adj.p-value<0.05時(shí)，認(rèn)為mRNA顯著差異表達(dá)；

(3)利用健康對照、非難治性哮喘及難治性哮喘患者氣道上皮細(xì)胞的mRNA轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因分析，通過對差異基因進(jìn)行信號通路和富集分析，明確與氣道重塑相關(guān)性最高的差異基因，確定難治性哮喘的候選生物標(biāo)志物：

①篩選差異表達(dá)基因：通過R語言篩選相對于健康對照與非難治性哮喘，在難治性哮喘患者氣道上皮細(xì)胞差異表達(dá)的基因，并通過Benjamini-Hochberg方法對p值進(jìn)行校正；

②差異表達(dá)基因篩選參數(shù)：Log FC>1,adj.p-value<0.05；

③信號通路和富集分析：通過metascape.org在線網(wǎng)站對差異表達(dá)基因進(jìn)行信號通路和富集分析，篩選出與氣道重塑相關(guān)性最高的差異表達(dá)基因；

④根據(jù)信號通路和富集分析結(jié)果，CTSC是與氣道重塑的相關(guān)性最高的差異基因，可能是難治性哮喘診斷與療效評估的生物標(biāo)志物；

(4)采用大樣本量qPCR驗(yàn)證CTSC基因的差異表達(dá)，最終確定CTSC是難治性哮喘診斷與療效評估的生物標(biāo)志物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種難治性哮喘檢測標(biāo)記物的篩選方法，其特征在于：所述的含有修復(fù)cDNA兩端不規(guī)則末端的酶組合包括外切酶、聚合酶和磷酸激酶，其中的外切酶活性消化3’端的單鏈突出，而聚合酶(Polymerase)活性補(bǔ)齊5’端的突出；同時(shí)磷酸激酶在5’末端加上后續(xù)連接反應(yīng)必需的磷酸基團(tuán)，再經(jīng)過Agencourt AMpure XP磁珠純化。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種難治性哮喘檢測標(biāo)記物的篩選方法，其特征在于：所述的在末端修飾完成的雙鏈cDNA兩邊3’末端加上單個(gè)腺苷酸“A”，防止cDNA片段之間的平末端自連，與下一步測序接頭5’末端的單個(gè)“T”突出互補(bǔ)配對。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種難治性哮喘檢測標(biāo)記物的篩選方法，其特征在于：所述的連接緩沖液中含有T4 DNA連接酶，利用T4 DNA連接酶將illumina測序接頭連接至文庫DNA兩端，反應(yīng)條件為：30℃孵育10分鐘。