[發(fā)明專利]一種快速高效的楸遺傳轉(zhuǎn)化方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910581221.5
• 申請(qǐng)日: 2019-06-29
• 公開（公告）號(hào): CN110305894B
• 公開（公告）日: 2023-01-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王鵬;呂芬妮;李亞;張恩亮;楊如同;高露璐;李林芳;李素梅;汪慶
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82
• 代理公司: 南京匯盛專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32238
• 代理人: 裴詠萍

1.一種快速高效的楸遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1) 遺傳轉(zhuǎn)化受體的獲得與增殖：

a) 子葉愈傷組織的誘導(dǎo)：成熟的楸種子經(jīng)75%酒精表面滅菌60 s，無菌水沖洗2次，再浸泡于0.1%氯化汞溶液18 min，無菌水沖洗5次后平鋪于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，25-28℃，暗培養(yǎng)20 d，獲得愈傷組織；

b) 胚性愈傷組織的誘導(dǎo)：將誘導(dǎo)出的黃綠色子葉愈傷組織轉(zhuǎn)置于胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，25-28℃，光強(qiáng)1500lx，12 h/d的光下培養(yǎng)，每隔20 d繼代，直至產(chǎn)生胚性愈傷組織；

c) 胚性愈傷組織的增殖：將誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)置于胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基，25-28℃，光強(qiáng)1500lx，12 h/d的光下培養(yǎng)，每隔20 d繼代，使胚性愈傷增殖，以滿足后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化需求；

(2) 攜帶目的基因的農(nóng)桿菌的制備：將含有目的基因的植物表達(dá)載體通過凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)中，挑取單克隆，目的基因PCR檢測(cè)確定陽性單克隆后，過夜搖菌，收集菌體，由重懸液重懸；所述農(nóng)桿菌采用農(nóng)桿菌EHA105，農(nóng)桿菌重懸液濃度OD600=0.60-0.65；所述重懸液是MS + 蔗糖30 g/L；

(3) 胚性愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化：將增殖的胚性愈傷組織接入重懸的農(nóng)桿菌菌液中，菌液完全浸沒胚性愈傷組織，100 rpm，20 min，吸水紙吸干胚性愈傷組織表面的菌液后，平鋪于共培養(yǎng)培養(yǎng)基，25-28℃，暗培養(yǎng)48 h；所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基是MS + 蔗糖30 g/L+ 瓊脂3 g/L；

(4) 植株再生及生根：將共培養(yǎng)后的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)置于含150 mg/L Kan的分化培養(yǎng)基上，并將其堆積為大小合適的愈傷堆，進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的選擇培養(yǎng)，25-28℃，光強(qiáng)1500lx，12h/d的光下培養(yǎng)；20 d后，將存活的抗性胚性愈傷組織轉(zhuǎn)置于含100 mg/L Kan的分化培養(yǎng)基上，培養(yǎng)20 d后，再將存活的抗性胚性愈傷組織轉(zhuǎn)置于含50 mg/L Kan的分化培養(yǎng)基上，逐級(jí)篩選；2-3個(gè)月即可獲得再生苗，再生苗株高2.5-4 cm轉(zhuǎn)置于生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)；

(5) 再生植株檢測(cè)：對(duì)步驟(4)中的抗性再生植株幼苗進(jìn)行報(bào)告基因的表達(dá)檢測(cè)，同時(shí)，取再生植株的葉片，提取DNA，進(jìn)行目的基因的PCR檢測(cè)；

(6) 轉(zhuǎn)基因植株煉苗及移栽：將根系健壯的轉(zhuǎn)基因陽性苗的瓶蓋擰開后放置7d煉苗，然后取出陽性苗，洗凈根上滯留的培養(yǎng)基后移入裝有營(yíng)養(yǎng)土的花盆中并放置在保溫棚中，一周后移出；所述營(yíng)養(yǎng)土為泥炭土與珍珠巖以3:2混合。

2.如權(quán)利要求1所述的一種快速高效的楸遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于：所有培養(yǎng)基均調(diào)節(jié)pH值到5.8-6.0。

3.如權(quán)利要求1所述的一種快速高效的楸遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于：愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基是MS + 6-BA (6-Benzylaminopurine，6-芐氨基腺嘌呤) 0.5 mg/L + NAA (1-Naphthylacetic aci，萘乙酸) 0.2 mg/L + 蔗糖30 g/L+ 瓊脂3 g/L。

4.如權(quán)利要求1所述的一種快速高效的楸遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于：胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是DKW + 6-BA 0.6 mg/L + NAA 0.15 mg/L + 蔗糖30 g/L+ 瓊脂3 g/L。

5.如權(quán)利要求1所述的一種快速高效的楸遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于：胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基是MS + 6-BA 0.6 mg/L + NAA 0.15 mg/L+ 蔗糖30 g/L+ 瓊脂3 g/L。

6.如權(quán)利要求1所述的一種快速高效的楸遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于：添加抗生素的分化培養(yǎng)基是DKW + 6-BA 0.6 mg/L + NAA 0.15 mg/L + ZT (Zeatin，玉米素) 0.2 mg/L +蔗糖30 g/L + 50-150 mg/L Kan (Kanamycin，卡那霉素) + 瓊脂3 g/L；轉(zhuǎn)化胚性愈傷組織初次轉(zhuǎn)置于含150 mg/L Kan的分化培養(yǎng)基，20 d后繼代，轉(zhuǎn)置于含100 mg/L Kan的分化培養(yǎng)基，20 d后，轉(zhuǎn)置于含50 mg/L Kan的分化培養(yǎng)基。