[發明專利]以殼聚糖修飾PLGA的大腸桿菌Vo外膜蛋白納米粒疫苗及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201910575081.0
• 申請日: 2019-06-28
• 公開（公告）號: CN110302369B
• 公開（公告）日: 2022-04-29
• 發明（設計）人: 孫紅武;顧江;張瑾;趙莉群;楊赟;王穎;高晨;韋金佞;程新;張衛軍;鄒全明
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍陸軍軍醫大學
• 主分類號: A61K39/108
• 分類號: A61K39/108;A61K9/51;A61K47/34;A61K47/36;A61P31/04;A61P25/00
• 代理公司: 重慶航圖知識產權代理事務所(普通合伙) 50247
• 代理人: 王貴君

本發明公開了以殼聚糖修飾PLGA的大腸桿菌Vo外膜蛋白納米粒疫苗及其制備方法和應用，該納米粒疫苗粒徑為200nm～300nm，PdI值在0.02?0.3之間；其制備方法如下：將Vo蛋白溶液加入含聚乙烯醇和多磷酸鈉的溶液中，然后攪拌下加入丙酮溶解的聚乳酸?羥基乙酸共聚物溶液，接著攪拌下加入冰醋酸溶解的殼聚糖溶液，充分分散，過濾，離心洗滌獲得納米粒疫苗；制得的該疫苗對大腸桿菌K1感染保護效果好，與Al(OH)_3佐劑吸附的Vo疫苗相當，無顯著統計學差異，可作為預防大腸桿菌K1感染引起相關疾病的疫苗，對大腸桿菌K1感染引起相關疾病的預防和治療具有重要意義。

技術領域

本發明涉及納米疫苗領域，具體涉及以殼聚糖修飾PLGA的大腸桿菌Vo外膜蛋白納米粒疫苗，還涉及該疫苗的制備方法和應用。

背景技術

大腸桿菌K1(E.coli K1)是引發新生兒細菌性腦膜炎的第二大病原體,感染后死亡率高，且治愈患兒常并發各種神經系統后遺癥，如腦積水、癲癇、智能低下等，為家庭和社會造成嚴重的負擔。文獻報道，在Ecoli.K1感染所致新生兒腦膜炎中致死率為5-40％，且恢復的患兒中有30％伴有神經系統后遺癥。外膜蛋白A(Outer membrane A,OmpA)是E.coliK1的關鍵致病因子，其胞外的Loops在E.coli K1感染新生兒腦膜炎中發揮重要作用。在整個新生兒腦膜炎的發病過程中，E.coli K1能對抗機體免疫系統的逃逸并引發菌血癥、入侵血腦屏障導致顱內感染，在介導引發感染性疾病過程中發揮重要作用。因此，以OmpA為靶點設計疫苗，理論上可提供良好的免疫保護效果。OmpA為I型跨膜蛋白，其全長346個氨基酸，N端結構域是其主要功能結構域，其暴露在胞外的loop1，loop2，loop3，loop4是其介導OmpA相關病理生理過程的關鍵結構域。在此基礎上，前期以OmpA的胞外Loops為基礎的重組蛋白Vo，其結構為loop1-linker-loop2-linker-loop3--linker-loop4-linker-loop1-linker-loop2-linker-loop3--linker-loop4，并通過動物實驗發現Vo具有良好的免疫原性和免疫保護效果，是較好的候選疫苗抗原。但由于Vo非天然蛋白、其穩定性有限，且Vo的分子量較低、在體內易被酶解、生物利用度低，這些原因限制了Vo在臨床上的進一步應用。

納米粒(nanoparticle，NP)是指通過各種技術制備的高分子膠體固態粒子，其粒徑大小為1～1000nm，可在水中形成近似于膠體溶液，具有界面效應和尺寸效應。自德國科學家Kreuter首次將納米粒應用于疫苗遞送以來，納米粒尤其是生物可降解材料制備的納米粒，已經在疫苗研究領域廣泛應用。與傳統疫苗制劑相比，納米粒具如下優勢：(1)維持藥物活性和穩定。對藥物有保護作用，可以減少酶對藥物的降解，保持藥物活性。(2)增強藥物作用的靶向性。通過對納米粒的修飾，可以增強細胞對納米粒的吞噬，可以將納米粒靶向到機體的特定器官及組織，優化包裹抗原的免疫途徑；(3)納米粒均一性良好，包裹或吸附抗原后可成為巨噬細胞中和首選的吞噬目標，提高機體對抗原的免疫應答。

PLGA是FDA和SFDA批準的可用于醫用手術輔料及埋植劑緩釋劑輔料，其具有親水性、擴散性和在人體內的快速代謝的特點。PLAG納米粒可以作為抗原載體包裹生物活性大分子藥物如多肽、蛋白質或核酸等，達到保護抗原降解的作用。但是其納米粒表面缺乏可共價修飾的功能基團以及在體內停留時間短，限制了其在疫苗載體領域的應用。殼聚糖是一種具有生物降解性和生物相容性的陽離子聚合物，具有較低的免疫原性。殼聚糖聚合物骨架上的伯氨基可促進其與其他化學試劑的結合。殼聚糖可通過非共價靜電吸附對PLGA納米粒子進行表面修飾。殼聚糖(帶正電荷)的胺基與PLGA(帶負電荷)核之間的相互作用可以降低靜電斥力，導致更大的靈活性，并可形成更緊湊的結構。

因此，有必要開發適應臨床應用的利用PLGA和CS的Vo納米粒疫苗，提高機體對抗原的免疫應答，且能靶向細胞內，安全，穩定性好。

發明內容