[發明專利]檢測GATA3基因相對表達量的雙通道實時熒光定量RT-PCR方法

在審

• 申請號: 201910574974.3
• 申請日: 2019-06-28
• 公開（公告）號: CN110241186A
• 公開（公告）日: 2019-09-17
• 發明（設計）人: 王婷;劉翌超;石麗;問宇昕
• 申請（專利權）人: 陜西科技大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 范巍

1.一種用于實時熒光定量RT-PCR反應的引物探針組合，其特征在于：包括特異性擴增GATA3基因及β-actin基因部分片段的引物及TaqMan探針：

GATA3上游引物GF：5'-TAGAGCCCTGCTCGATGCT-3'；

GATA3下游引物GR：5'-GATACTGCTCCTGCAAAAAT-3'；

GATA3探針GP：5'-FAM-CCCAGCGAGAGTCCCTGCAGTCC-BHQ1-3'；

β-actin上游引物AF：5'-CAGCAGATGTGGATCAGCAAG-3'；

β-actin下游引物AR：5'-GCATTTGCGGTGGACGAT-3'；

β-actin探針AP：5'-CY5-AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC-BHQ1-3'。

2.根據權利要求1所述一種用于實時熒光定量RT-PCR反應的引物探針組合，其特征在于：所述GATA3探針GP中FAM為6-carboxyfluorescein。

3.一種檢測GATA3基因相對表達量的雙通道實時熒光定量RT-PCR方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)以GATA3基因為檢測的目標基因，針對GATA3基因部分片段設計特異性擴增引物和TaqMan探針：

GATA3上游引物GF：5'-TAGAGCCCTGCTCGATGCT-3'；

GATA3下游引物GR：5'-GATACTGCTCCTGCAAAAAT-3'；

GATA3探針GP：5'-FAM-CCCAGCGAGAGTCCCTGCAGTCC-BHQ1-3'；

2)以β-actin基因為檢測的內參基因，針對β-actin基因部分片段設計特異性擴增引物和TaqMan探針：

β-actin上游引物AF：5'-CAGCAGATGTGGATCAGCAAG-3'；

β-actin下游引物AR：5'-GCATTTGCGGTGGACGAT-3'；

β-actin探針AP：5'-CY5-AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC-BHQ1-3'；

3)從待測樣本中提取總RNA，得到待測樣本總RNA；

4)將RT-PCR緩沖液、反轉錄酶、Taq酶、待測樣本總RNA、針對GATA3基因的擴增引物和TaqMan探針以及針對β-actin基因的擴增引物和TaqMan探針混合，得反應體系；

5)將反應體系按照反應程序進行反轉錄及實時熒光定量PCR反應，其中，分別利用FAM通道和CY5通道進行雙通道熒光采集；

6)根據實時熒光定量PCR的定量結果，采用雙標準曲線法計算待測樣本中GATA3基因的相對表達量。

4.根據權利要求3所述一種檢測GATA3基因相對表達量的雙通道實時熒光定量RT-PCR方法，其特征在于：所述反應體系中，GATA3上游引物GF的濃度為150-250nM，GATA3下游引物GR的濃度為150-250nM，GATA3探針GP的濃度為100-150nM，β-actin上游引物AF的濃度為150-200nM，β-actin下游引物AR的濃度為150-200nM，β-actin探針AP的濃度為100-150nM，待測樣本總RNA的含量≥10ng。

5.根據權利要求3所述一種檢測GATA3基因相對表達量的雙通道實時熒光定量RT-PCR方法，其特征在于：所述反應程序為：42℃反轉錄5min；95℃預變性10s；95℃變性5s，60℃退火34s，進行35-40個擴增循環，并從第一個循環開始采集熒光信號。

6.根據權利要求3所述一種檢測GATA3基因相對表達量的雙通道實時熒光定量RT-PCR方法，其特征在于：根據實時熒光定量PCR的定量結果，若GATA3基因對應的Ct值≤30，則判定GATA3基因在待測樣本中表達。