[發(fā)明專利]一種酪氨酸酚裂解酶基因重組質(zhì)粒及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910571335.1
• 申請(qǐng)日: 2019-06-28
• 公開（公告）號(hào): CN110373421A
• 公開（公告）日: 2019-10-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭仁朝;湯曉玲;鄭裕國(guó)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12N15/65;C12N15/60;C12N9/88;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發(fā)明公開了一種酪氨酸酚裂解酶基因重組質(zhì)粒及應(yīng)用，本發(fā)明在質(zhì)粒上將cer基因座插入到含有卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒上，在不加卡那抗生素情況下，在cer作用下，發(fā)酵20?48h后，質(zhì)粒穩(wěn)定性維持在60％?90％，F(xiàn)n?TPL體積酶活達(dá)到10000?12000U/L。本發(fā)明在含有卡那霉素抗性基因和cer1基因座，在加了卡那霉素情況下，發(fā)酵20?48h后，質(zhì)粒穩(wěn)定性維持為100％，F(xiàn)n?TPL體積酶活達(dá)到12000?15000U/L。

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種酪氨酸酚裂解酶基因重組質(zhì)粒及應(yīng)用。

(二)背景技術(shù)

酪氨酸酚裂解酶(tyrosine phenol lyase,TPL,E.C.4.1.99.2)，又名β-酪氨酸酶，是一種磷酸吡哆醛(pyridoxal-5’-phosphate,PLP)依賴型酶，催化L-酪氨酸裂解生成苯酚、丙酮酸和氨。此反應(yīng)為可逆反應(yīng)，若以鄰苯二酚替代苯酚，該酶可逆向催化生成左旋多巴。TPL催化合成左旋多巴原子經(jīng)濟(jì)性高、反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好。

為獲得高表達(dá)量的目標(biāo)產(chǎn)物，外源基因通常連接于質(zhì)粒后導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建了組成型具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)TPL(Fn-TPL)大腸桿菌表達(dá)體系，利用重組大腸桿菌作為催化劑，催化鄰苯二酚、丙酮酸鈉和銨一步合成左旋多巴。高密度發(fā)酵是獲得高重組大腸桿菌生物量和TPL酶活的重要工業(yè)手段，一般采用分批補(bǔ)料方式進(jìn)行，而在發(fā)酵過程中，質(zhì)粒穩(wěn)定性因素嚴(yán)重影響產(chǎn)酶。一方面，質(zhì)粒及其表達(dá)的蛋白對(duì)重組菌生長(zhǎng)構(gòu)成負(fù)擔(dān)，另一方面，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后，有害代謝物和目的產(chǎn)物開始積累，對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生逆境壓力，將激發(fā)細(xì)胞清除體內(nèi)外源質(zhì)粒的脅迫反應(yīng)，從而導(dǎo)致質(zhì)粒的減少或者丟失。保持質(zhì)粒穩(wěn)定性在發(fā)酵生產(chǎn)中具有非常重要的意義。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種酪氨酸酚裂解酶基因重組質(zhì)粒及其在提高酪氨酸酚裂解酶酶活中的應(yīng)用，將卡納霉素抗性基因和cer基因座連接到質(zhì)粒上，以達(dá)到提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的目的，提高E.coli BL21(DE3)宿主細(xì)胞質(zhì)粒穩(wěn)定性，增加酪氨酸酚裂解酶(Fn-TPL)的產(chǎn)量，不僅有利于重組菌的發(fā)酵生產(chǎn)，更可以減少抗生素的使用，減低成本，避免對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種酪氨酸酚裂解酶基因重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒是將卡那霉素抗性基因(KanR)、cer基因與酪氨酸酚裂解酶基因共同導(dǎo)入載體獲得的；所述卡那霉素抗性基因(KanR)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述cer基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

進(jìn)一步，所述載體為組成型表達(dá)質(zhì)粒pET-3a。

進(jìn)一步，所述酪氨酸酚裂解酶基因Fn-TPL核苷酸序列為SEQ ID NO.3所示。

本發(fā)明所述酪氨酸酚裂解酶基因重組質(zhì)粒按如下方法構(gòu)建：將酪氨酸酚裂解酶基因Fn-TPL與線性化質(zhì)粒pET-3a連接，獲得質(zhì)粒pET-3a-Fn-TPL；再將卡那霉素抗性基因(KanR)與線性化質(zhì)粒pET-3a-Fn-TPL連接，獲得質(zhì)粒pET-3a-KanR-Fn-TPL；最后將cer基因與線性化質(zhì)粒pET-3a-KanR-Fn-TPL連接，獲得重組質(zhì)粒pET-3a-KanR-cer-Fn-TPL。

本發(fā)明還提供一種所述酪氨酸酚裂解酶基因重組質(zhì)粒構(gòu)建的基因工程菌，所述工程菌以大腸桿菌E.coli BL21(DE3)為宿主構(gòu)建而成。

本發(fā)明提供一種所述酪氨酸酚裂解酶基因重組質(zhì)粒在提高酪氨酸酚裂解酶產(chǎn)量中的應(yīng)用，具體所述方法為：(1)將酪氨酸酚裂解酶基因重組質(zhì)粒構(gòu)建的工程菌接種至含100μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)15h，獲得活化菌體；

(2)挑平板上單菌落接種于50mL含100μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37℃、180rpm培養(yǎng)8h，作為種子液備用；