[發(fā)明專利]天麻GeCPR基因及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910561632.8
• 申請日: 2019-06-26
• 公開（公告）號: CN110305855B
• 公開（公告）日: 2022-03-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李昆志;范丹楠;肖舒卉;劉云霞;陳麗梅;徐慧妮
• 申請（專利權(quán)）人: 昆明理工大學(xué)
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/80;C12P7/22;C12R1/645
• 代理公司: 北京隆達恒晟知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11899
• 代理人: 楊青

本發(fā)明涉及天麻GeCPR基因及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，所述的天麻GeCPR基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示；所述的天麻GeCPR基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示；利用GeCPR基因構(gòu)建真核表達載體pH2?35S?GeCPR，轉(zhuǎn)化蜜環(huán)菌，獲得陽性克隆轉(zhuǎn)基因蜜環(huán)菌菌株，能將4?甲酚轉(zhuǎn)化為4?羥基苯甲醇。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及天麻GeCPR基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

天麻是一種真菌營養(yǎng)型蘭科植物，是一種名貴的中藥材，能夠鎮(zhèn)靜催眠、抗暈厥、改善記憶力、還能夠提高免疫力，天麻中重要成分天麻素和對羥基苯甲醇，天麻素能夠在治療類似心肌肥厚等心腦血管疾病，阿茲海默癥，老年癡呆癥、高血糖等疾病方面有較好的療效。

已知天麻素合成方法有化學(xué)合成及生物合成，化學(xué)合成所需的底物有五乙酰-β-D-葡萄糖，對甲基苯酚，對羥基苯甲醇等，這些物質(zhì)經(jīng)過一系列生化反應(yīng)，最終合成天麻素。由于天麻素在生物合成中產(chǎn)量較低，且合成方法大多復(fù)雜或存在一定危險性，提高天麻素產(chǎn)量成為研究熱點。細胞色素P450基因在植物體內(nèi)能夠參與催化多種初級次級代謝反應(yīng)，天麻中主要的藥用成分4-羥基苯甲醇和天麻素，藥典規(guī)定這兩者總含量不能低于0.25%含量，其中4-羥基苯甲醇是天麻素前體物質(zhì)，可以通過細胞色素P450催化合成。細胞色素P450還原酶（CPR）是細胞色素P450氧化酶系（CYPs）中的重要組成部分，它能夠傳遞電子至CYP450的活性中心，控制CYP450氧化還原反應(yīng)的速度，參與CYPs催化的初級和次級代謝，目前有研究表明在大腸桿菌中異源表達CYP450可以實現(xiàn)天麻素的生物合成。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服背景技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了GeCPR基因及其應(yīng)用，篩選獲得天麻CPR合成的相關(guān)基因GeCPR，通過構(gòu)建GeCPR基因植物表達載體，再經(jīng)農(nóng)桿菌pMP90轉(zhuǎn)染蜜環(huán)菌，獲得具有合成4-羥基苯甲醇的功能的GeCPR轉(zhuǎn)基因蜜環(huán)菌菌株。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

天麻GeCPR基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。

所述的天麻GeCPR基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。

所述的天麻GeCPR基因在4-羥基苯甲醇合成過程中的應(yīng)用，具體地是，利用GeCPR基因構(gòu)建真核表達載體pH2-35S-GeCPR，轉(zhuǎn)化蜜環(huán)菌，獲得陽性克隆轉(zhuǎn)基因蜜環(huán)菌菌株，能將4-甲酚轉(zhuǎn)化為4-羥基苯甲醇。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明篩選獲得天麻CPR合成的相關(guān)基因GeCPR，通過構(gòu)建GeCPR基因植物表達載體，再經(jīng)農(nóng)桿菌pMP90轉(zhuǎn)染蜜環(huán)菌，獲得具有合成4-羥基苯甲醇的功能的GeCPR轉(zhuǎn)基因蜜環(huán)菌菌株。

附圖說明

圖1為GeCPR全長基因的PCR擴增；

圖2為真核表達載體pH2-35S-GeCPR酶切及PCR檢測，圖中，A：酶切檢測，M：DL2000DNAmaker；1～2 pH2-35S-GeCPR質(zhì)粒雙酶切；3 pENTR2B-GeCPR質(zhì)粒雙酶切；B：PCR檢測；

圖3為轉(zhuǎn)基因蜜環(huán)菌PCR檢測，圖中，M:DL5000DNAmaker，1～4:轉(zhuǎn)基因蜜菌，5:非轉(zhuǎn)基因蜜環(huán)菌，6:空白對照；

圖4為轉(zhuǎn)基因蜜環(huán)菌轉(zhuǎn)化效率圖。

具體實施方式

實施例1：GeCPR全長基因的獲得

從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出P450基因具有5’端前段基因序列，通過巢式PCR擴增基因序列：

巢式PCR第一步，設(shè)計好兩條上游引物，以及通用引物，引物由上海擎科合成。