[發明專利]一種基于LC-MS/MS技術篩選金銀花黃色花瓣標記類胡蘿卜素代謝物的方法

在審

• 申請號: 201910560359.7
• 申請日: 2019-06-26
• 公開（公告）號: CN110412153A
• 公開（公告）日: 2019-11-05
• 發明（設計）人: 夏燕;梁國魯;郭啟高;景丹龍;陳薇薇;孫海艷;王丹;石敏
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 北京智為時代知識產權代理事務所(普通合伙) 11498
• 代理人: 王加嶺;楊靜

本發明涉及一種基于LC?MS/MS技術檢測金銀花花瓣類胡蘿卜素方法，包括以下步驟：采集并剝取金銀花的花瓣，對花瓣類胡蘿卜素物質進行提取、復溶，UPLC分離、MS/MS檢測，對類胡蘿卜素進行定性、定量分析。本發明通過對金銀花不同顏色花瓣類胡蘿卜素物質檢測、分析技術的開發，建立了一套高效、快速和重復性好的金銀花花瓣類胡蘿卜素樣品前處理、提取、檢測、數據處理和差異代謝物篩選的技術，能有效地描述金銀花花瓣變色過程中不同顏色花瓣類胡蘿卜素物質含量的變化，評價各特定階段花瓣中各種類胡蘿卜素的含量水平。揭示金銀花不同顏色花瓣中類胡蘿卜素物質含量的差異，篩選黃色花瓣的標記類胡蘿卜素。

技術領域

本發明涉及植物花瓣類胡蘿卜素提取技術、儀器分析技術和數據分析技術領域，具體地說，涉及LC-MS/MS技術評價類胡蘿卜素在金銀花花瓣顏色變化中的作用。

背景技術

類胡蘿卜素是存在于自然界中的一大類植物花瓣色素物質，其所含的共軛雙鍵構成生色團，表現出黃、橙、紅和紫等顏色。很多植物花朵的橙色、黃色和紅色的形成與類胡蘿卜素的積累密切相關，花瓣中類胡蘿卜素的種類及其含量的多少都有可能影響花色表現。

類胡蘿卜素是一種脂溶性色素。目前類胡蘿卜素的提取方法主要是有機溶劑提取法和酶反應萃取法等，其中有機溶劑提取法是天然類胡蘿卜素提取最常用的方法。但因為類胡蘿卜素種類繁多，已知的就有700多種；結構也復雜多樣，已知的有60多種結構；并且不同植物材料中成分差異明顯，所以目前還沒有提取類胡蘿卜素的標準參考方法。超聲波作為一種植物有效成分的輔助提取技術，近年來已被廣泛應用與植物類胡蘿卜素的提取制備。利用超聲波的空化作用和次級效應，能夠在較短的時間內，顯著提高類胡蘿卜素的提取效果。

目前，類胡蘿卜素物質分析一般利用光譜和色譜技術進行。用于類胡蘿卜素成分分析的光譜技術主要有紫外可見光譜、紅外光譜和質譜等；色譜技術主要有薄層色譜、柱色譜、高效液相色譜和超臨界流體色譜等。但是，隨著質譜技術的不斷發展和完善，越來越多的植物有效成分都建立了質譜檢測技術。

金銀花(Lonicera japonica)是多年生常綠或落葉攀援灌木，忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬屬(Lonicera Linn)植物。金銀花花冠唇形，初開為白色，后漸變為黃色，黃白相映，景色宜人。因此，金銀花常被用作園林綠化的觀賞植物，可作藤架、盆景和籬緣綠化等，具有較高的經濟價值和社會效益。經研究，類胡蘿卜素的積累是金銀花花瓣最終變為金黃色的主要原因，但是，具體的類胡蘿卜素種類和及其含量變化未知。

花瓣中類胡蘿卜素種類的不同及其/或者含量的不同都有可能對花色產生影響，而對黃色系的花影響尤為明顯。金銀花發育過程中，尤其在變色階段，類胡蘿卜素代謝途徑及其產物合成和積累在調控花色變化方面的機理尚不清楚。基于金銀花不同顏色花瓣類胡蘿卜素代謝組結果分析，對揭示花瓣變色的內在機理和發現潛在的標記代謝物均有重要的意義。但是，目前有關黃色系花變色前后類胡蘿卜素代謝組學的研究尚無報道，尤其是基于LC-MS/MS技術對金銀花類胡蘿卜素代謝組檢測的樣品處理、提取、數據分析和標記代謝物篩選缺乏可靠的方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于LC-MS/MS技術對金銀花花瓣類胡蘿卜素代謝組進行測定和分析，并用來分析類胡蘿卜素積累對花瓣顏色變化影響的方法。

為了實現本發明目的，本發明提供了一種基于LC-MS/MS技術檢測金銀花花瓣類胡蘿卜素方法，其特征在于，包括以下步驟：采集并剝取金銀花的花瓣，對花瓣類胡蘿卜素物質進行提取、復溶，UPLC分離、MS/MS檢測，對類胡蘿卜素進行定性、定量分析。

進一步的，金銀花花瓣組織類胡蘿卜素物質的提取方法為：真空冷凍干燥花瓣樣品；將凍干樣品研磨至粉末狀；向粉末中加入提取液；渦旋后超聲；離心取上清；再往沉淀物中加入提取液，重復渦旋、超聲和離心，進行二次提取；最后合并兩次的上清液，液氮吹干。