[發(fā)明專利]一種檢測(cè)蛋白的試劑盒及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910559911.0
• 申請(qǐng)日: 2019-06-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110244041A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-09-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 施維;劉楊;黃宜兵
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/535
• 分類號(hào): G01N33/535;G01N33/533;G01N33/543;G01N33/68
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 瞿曉晶

1.一種檢測(cè)蛋白的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：

1)羊抗兔IgG與PAMAM的偶聯(lián)物；

2)羊抗鼠IgG與量子點(diǎn)的偶聯(lián)物；

3)待測(cè)蛋白的鼠抗A和兔抗B；

所述鼠抗A與兔抗B需滿足檢測(cè)同一抗原，且沒(méi)有交叉反應(yīng)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述待測(cè)蛋白包括細(xì)胞因子、胞內(nèi)蛋白、細(xì)胞表面蛋白和分泌型蛋白。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述羊抗鼠IgG與量子點(diǎn)的偶聯(lián)物的制備方法，包括以下步驟：

S1、將量子點(diǎn)溶解于活化液中，再依次加入Sulfo-NHS和EDC溶液，活化3～8min，離心棄去上清，將得到的沉淀用活化液溶解，得到活化量子點(diǎn)溶液；

所述活化液為含質(zhì)量濃度0.01％吐溫20的pH值為7.4的5mM BS緩沖液；

S2、將羊抗鼠IgG與步驟S1得到的活化量子點(diǎn)溶液混合，4℃下避光反應(yīng)10～16h，再加入質(zhì)量濃度8～15％的BSA，37℃下反應(yīng)20～40min，補(bǔ)加洗液，離心去上清，沉淀以洗液溶解，再次離心去上清，將沉淀于保存液中溶解，低速離心，收集上清，得到羊抗鼠IgG與量子點(diǎn)的偶聯(lián)物；

所述洗液為含質(zhì)量濃度0.01％吐溫20的5mM pH 8.0的BS緩沖液；

所述保存液為含質(zhì)量濃度10％的BSA的洗液。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述量子點(diǎn)包括濃度為5mg/mL的CdSe/ZnS核殼型羧基水溶性量子點(diǎn)；所述量子點(diǎn)溶解于5倍體積活化液；所述沉淀用3倍體積的活化液溶解；所述量子點(diǎn)與羊抗鼠IgG的質(zhì)量比為2.25mg：0.1mg；所述Sulfo-NHS和EDC的摩爾比為1:1。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述羊抗兔IgG與PAMAM的偶聯(lián)物的制備方法，包括以下步驟：

將60mg PAMAM溶解于2～5mL DMSO中，攪拌至完全溶解后加入琥珀酸酐，避光反應(yīng)3～5h，透析，凍干，得到改性后的PAMAM凍干粉；

將改性后的PAMAM凍干粉用MES緩沖液溶解，加入NHS和EDC，加入羊抗兔IgG抗體，4℃低溫反應(yīng)12～16h，以3500～5000MWCO的透析袋透析，后再用8000MWCO透析袋透析，凍干得到羊抗兔IgG與PAMAM的偶聯(lián)物。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述PAMAM與琥珀酸酐的電荷比例在1:(10～50)；NHS和EDC的摩爾比為1:1；所述EDC、NHS和羊抗兔IgG抗體的比例為40umol:40umol:1ug。

7.權(quán)利要求1～6任一項(xiàng)所述試劑盒在蛋白的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中的應(yīng)用。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)包括以下步驟：

(1)加入待測(cè)蛋白的鼠抗A和兔抗B進(jìn)行第一抗體的孵育，得到結(jié)合第一抗體的待測(cè)蛋白；

(2)將步驟(1)得到的結(jié)合第一抗體的待測(cè)蛋白和量子點(diǎn)與羊抗鼠IgG的偶合物和PAMAM與羊抗兔IgG的偶聯(lián)物混合，在37℃避光條件下進(jìn)行第二抗孵育，洗滌；

(3)上樣于流式分析儀進(jìn)行分析。

9.權(quán)利要求1～6任一項(xiàng)所述試劑盒在蛋白免疫組化檢測(cè)中的應(yīng)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述免疫組化檢測(cè)包括以下步驟：

N1、將待測(cè)蛋白與鼠抗A進(jìn)行第一抗體孵育；

N2、加入量子點(diǎn)與羊抗鼠IgG的偶合物，在37℃避光條件下進(jìn)行第二抗體孵育，洗滌；

N3、進(jìn)行細(xì)胞核染色，洗滌，鏡檢。