[發明專利]一種農桿菌介導的多主棒孢高效遺傳轉化方法

在審

• 申請號: 201910559279.X
• 申請日: 2019-06-26
• 公開（公告）號: CN110257416A
• 公開（公告）日: 2019-09-20
• 發明（設計）人: 高士剛;戴富明;曾蓉;徐麗慧;王良軍;楊曉峰
• 申請（專利權）人: 上海潤莊農業科技有限公司
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12R1/645
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

本發明提出了一種農桿菌介導的多主棒孢高效遺傳轉化方法，包括：(1)多主棒孢孢子懸浮液的制備步驟；(2)雙元載體pCAMBIA1300轉化農桿菌AGL1感受態細胞；篩選、鑒定陽性農桿菌轉化子；(3)活化上述陽性農桿菌轉化子，然后將單菌落轉到含利福平和卡那霉素的LB液體培養基中培養；(4)制備陽性農桿菌轉化子菌液；(5)混合菌液，并進行孵育；之后在含有乙酰丁香酮的IM培養基中培養；(6)多主棒孢陽性轉化子的抗性篩選。本發明的方法轉化效率高，操作簡單。

技術領域

本發明涉及遺傳轉化領域，特別是指一種農桿菌介導的多主棒孢高效遺傳轉化方法。

背景技術

多主棒孢(Corynespora cassiicola(Berk.&Curt.)Wei.)屬半知菌亞門棒孢菌屬絲狀真菌，可侵染黃瓜、番茄、煙草、橡膠、棉花等500多種蔬菜和經濟作物，引起葉斑病，每年發生面積超過66.7萬公頃，損失超過50億。致病相關基因的鑒定、克隆和功能分析將有助于揭示該病菌致病的分子機理以及病害的有效防控。目前，可采用PEG介導的原生質體遺傳轉化方法研究病菌的基因功能。

然而，一方面，PEG介導的原生質體遺傳轉化方法轉化效率低；另一方面，該方法對原生質的質量要求較高，限制了該方法在多主棒孢致病相關基因功能研究上的應用。

有鑒于此，有必要研發一種多主棒孢高效遺傳轉化方法。

發明內容

本發明提出一種農桿菌介導的多主棒孢高效遺傳轉化方法，解決了現有技術中PEG介導的原生質體遺傳轉化方法轉化效率低的問題。

本發明的技術方案是這樣實現的：

一種農桿菌介導的多主棒孢高效遺傳轉化方法，包括：

(1)多主棒孢孢子懸浮液的制備步驟；

(2)雙元載體pCAMBIA1300轉化農桿菌AGL1感受態細胞；篩選、鑒定陽性農桿菌轉化子；

(3)活化上述陽性農桿菌轉化子，然后將單菌落轉到含利福平和卡那霉素的LB液體培養基中培養；

(4)取步驟(3)中培養后的菌液，離心收集菌體；用含有乙酰丁香酮的IM培養基洗滌所述菌體，然后再用含有乙酰丁香酮的IM培養基重懸該菌體，將菌體濃度稀釋至OD6₀₀＝0.2～0.25；之后震蕩培養使OD₆₀₀在0.6～0.8，即為即為陽性農桿菌轉化子菌液；

(5)混合步驟(1)制備的多主棒孢孢子懸浮液與步驟(4)制備的陽性農桿菌轉化子菌液，并進行孵育；之后在含有乙酰丁香酮的IM培養基中培養；

(6)多主棒孢陽性轉化子的抗性篩選：將步驟(5)在選擇性CYA培養基上進行抗性篩選，暗箱培養直至出現明顯的單菌落，即為候選轉化子；所述選擇性CYA培養基含有頭孢和潮霉素；將所述候選轉化子連續在含頭孢的CYA培養基上傳5代后，接種于PDA培養基上培養并產生分生孢子；制備分生孢子懸浮液并涂布于含潮霉素的選擇性PDA培養基上，進一步篩選穩定遺傳的多主棒孢陽性轉化子。

作為優選的技術方案，所述多主棒孢孢子懸浮液的制備步驟如下：

多主棒孢菌(HG20101029-1)在PDA培養基上25℃培養10d，每天交替進行12h光照、12h黑暗；在PDA培養基中加入ddH₂O，用毛筆將孢子洗下來，再用無菌紗布過濾；室溫離心收集孢子，用ddH₂O重懸孢子，將孢子懸浮液的孢子濃度調成2×10⁵CFU/mL。

作為優選的技術方案，所述LB液體培養基中含有100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素。

作為優選的技術方案，所述陽性農桿菌轉化子的活化條件為：