[發(fā)明專利]一種人源諾如病毒免疫膠體金試劑盒及細(xì)胞株

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910555785.1
• 申請日: 2019-06-25
• 公開（公告）號: CN110221080B
• 公開（公告）日: 2021-09-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王大鵬;徐夢;張子蕾;劉丹蕾;魯飛鳳;王楠
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/569;G01N33/577;G01N33/558;G01N33/543;G01N33/531;C12N5/20;C07K16/10;C12N15/40;C12N15/70;C12R1/91
• 代理公司: 上海旭誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

1.一種人源諾如病毒免疫膠體金試劑盒，包括固相載體、檢測抗體和樣品處理液，其中所述固相載體包括樣品墊、膠體金結(jié)合墊、具有檢測線和質(zhì)控線的承載膜、吸收墊及底板，所述膠體金結(jié)合墊包括結(jié)合墊本體和涂覆于所述結(jié)合墊本體上的膠體金標(biāo)記抗體涂層，所述檢測線位于所述承載膜的靠近所述膠體金結(jié)合墊一端，所述質(zhì)控線位于所述承載膜的靠近所述吸收墊一端，其特征在于，所述檢測線為能夠與所述膠體金標(biāo)記抗體特異性結(jié)合的配對抗體形成的涂層，所述膠體金結(jié)合墊和所述檢測線使用的抗體為GI或GII組人源諾如病毒衣殼蛋白S區(qū)的單克隆抗體；所述質(zhì)控線為羊抗鼠二抗形成的涂層；所述GI或GII組人源諾如病毒衣殼蛋白S區(qū)的單克隆抗體通過以下步驟制備：

步驟一、 擴(kuò)增所述GI或GII組人源諾如病毒衣殼蛋白S區(qū)編碼基因，通過限制性內(nèi)切酶在酶切位點(diǎn)酶切將其插入原核表達(dá)載體pET-28a，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-S，其中所述酶切位點(diǎn)為上游EcoRI，下游XhoI；

步驟二、 將所述步驟一中得到的所述重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-S轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)所述GI或GII組人源諾如病毒衣殼蛋白S區(qū)的表達(dá)，得到誘導(dǎo)后的重組細(xì)菌；

步驟三、收集并破碎誘導(dǎo)后的所述重組細(xì)菌免疫實(shí)驗(yàn)動物；免疫后，適時(shí)融合所述免疫實(shí)驗(yàn)動物的脾細(xì)胞與骨髓瘤，以差異性ELISA法篩選雜交瘤細(xì)胞株，獲得只分泌所述GI或GII組人源諾如病毒衣殼蛋白S區(qū)特異性抗體的陽性細(xì)胞株，所述陽性細(xì)胞株通過普通培養(yǎng)法得到含有只針對所述GI或GII組人源諾如病毒衣殼蛋白S區(qū)的單克隆抗體細(xì)胞上清液，或者將所述細(xì)胞株注入所述免疫實(shí)驗(yàn)動物腹腔內(nèi)獲得含有只針對所述GI或GII組人源諾如病毒衣殼蛋白S區(qū)的所述單克隆抗體的腹水；

步驟四、 將所述步驟三中得到的含有所述單克隆抗體的細(xì)胞培養(yǎng)上清液或腹水進(jìn)行純化，得到純化的所述GI或GII組人源諾如病毒衣殼蛋白S區(qū)的單克隆抗體；

所述步驟一中還需引入上游擴(kuò)增引物P1和下游擴(kuò)增引物P2，針對所述GI組人源諾如病毒衣殼蛋白S區(qū)的所述上游擴(kuò)增引物和下游擴(kuò)增引物的核酸序列分別為5’GAATTCATGATGATGGCGTCTAAG 3’和5’ CTCGAGCTCCACCGTAGGAGGGAC 3’；針對所述GII組人源諾如病毒衣殼蛋白S區(qū)的所述上游擴(kuò)增引物和下游擴(kuò)增引物的核酸序列分別為5’GAATTCATGAAGATGGCGTCGAGTG3’和5’ CTCGAGCTCAACTGTGGGTGGCAC 3’；

所述步驟三中可以直接采用初步純化或者未純化地重組蛋白免疫所述實(shí)驗(yàn)動物。

2.如權(quán)利要求1所述的一種人源諾如病毒免疫膠體金試劑盒，其特征在于，所述承載膜采用NC膜，所述底板采用PVC材料。

3.如權(quán)利要求1所述的一種人源諾如病毒免疫膠體金試劑盒，其特征在于，所述樣品處理液包括PBS溶液和DTT溶液，其中所述PBS溶液的pH值為9，所述DTT溶液的濃度為10.0%（w/v）。

4.如權(quán)利要求1所述的一種人源諾如病毒免疫膠體金試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中所述固相載體和所述檢測抗體的搭配組合可采用以下方式：（1）納米金顆粒標(biāo)記的所述單克隆抗體與同種的所述單克隆抗體搭配；（2）納米金顆粒標(biāo)記的所述單克隆抗體與對應(yīng)的所述單克隆抗體中具有不同抗原表位的單克隆抗體搭配。

5.如權(quán)利要求1所述的一種人源諾如病毒免疫膠體金試劑盒，其特征在于，所述差異性ELISA法篩選為含所述重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-S和空的所述原核表達(dá)載體pET-28a的所述誘導(dǎo)后的重組細(xì)菌的裂解物包被固相載體，分別與待篩選的單克隆抗體細(xì)胞株所分泌的抗體進(jìn)行反應(yīng)，只與含所述重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-S的所述誘導(dǎo)后的重組細(xì)菌的裂解物反應(yīng)，而不與空的所述原核表達(dá)載體pET-28a的所述誘導(dǎo)后的重組細(xì)菌的裂解物反應(yīng)的細(xì)胞株定為陽性，從而獲得分泌針對不同基因型諾如病毒衣殼蛋白S區(qū)抗體的陽性細(xì)胞株。